Detecção de Genes Diferencialmente
ra 8 Perfil eletroforético em gel de políacrilamida 6%, não desnaturante, °btidos com os primers HT11G-AP05 A seta indica o fragmento em L1, L
e L3.
Figura 9. Distribuição das sequências com identidade uma sequência específica
de adultos (RV, RI e O) de M. scutellaris, por meio de BLASTn.
A combinação HT11G-AP05 revelou, em L1 e L2, um produto cuja
seqüencia (Figura 10) analisada por comparação em banco de dados (Figura 10) mostrou identidade com um domínio protéíco de tiorredoxina dissulfeto redutase
de Clostridium sporogenes. AGGAAGCTTACAATTTCATCGGTAATTTTTATTTGTCCACCTAG AGCATTTCTATCTAATACTAATGTATTAAGCTTTGCTCTGCCAG CGTATATAGCAGCACTAAGTCCAGAAGGTCCAGAGCCAATTAT AATTAAATCGTAGATACTATCCGCCATAAATGAACCTCCTATAA TTTGCCTACTAAGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCAT GCAAGCTTGG
Figura 10: Sequência do fragmento específico deL1 e L2 de Melipona scutellaris
pela combinação dosprimers HT11G-AP05
<40
Figura 11. Distribuição das sequências com identidade à seqüência analisada apresentada, por meio de BLASTx, A seta indica a região do alinhamento entre a seqüência referente às fases L1 e L2 de M. scutellaris com domínio protéíco de tiorredoxina díssulfeto reductase de Clostridium sporogenes
A tiorredoxina redutase (TrxR) é uma flavoproteína que catalisa a redução de tiorredoxina dependente de NADPH e que tem função na manutenção de um ambiente celularredutor(WILLIAMS JR etal, 2000).
A TrxR faz parte de um sistema que protege a célula contra espécies de
oxigênio reativo, subprodutos citotóxicos, que podem danificar a célula. Em
Drosophila, a TrxR age como antioxidante intracelular e mutantes para essa
enzima têm capacidade reduzida de proteger adequadamente as células de danos citotóxicos, resultando em morte da larva. Mutantes para redução dessa enzima apresentam dificuldade de eclosão e tem o tempo de vida diminuído
(MISSIRLIS ef a/2001)
Em bovino, já foi demonstrado que a tiorredoxina otimiza o
desenvolvimento de embrião, in vitro, mostrando seu efeito em momentos
específicos (BING etal2003).
Em Melipona scutellaris uma enzima, que tenha similaridade com essa, pode ser importanteno início do desenvolvimento embrionário, quando há intensa
atividade fisiológica e contínuo fluxo de alimento, o qual e oferecido de uma so
Vez (alimentação massal) paraa larva recém eclodida.
Em L1 e L2 , a combinação dosprimers HT11G-OPA16 revelou umproduto
101 bases (Figura 12) que analisado em BLAST mostrou identidade com a
Pr°teína SALL1 de Drosophila (Figura 13).
GgCAGCGAATTTGAAGAAGCGCCTTCTCAGTAATAGTTTTT
^ACATAGAGTTTACAATNGGCACTTTTTAGGGGACTAAGG bGTGGGATTTGNGCCTGGT
9ura 72. Sequência do fragmentoespecífico de L1 eL2de Melipona scutellarís
t^tido pela combinação dos primersHT11G-OPA16
I.I
apresentando similaridade, por meio de F'9üra 13: Distribuição das sequenCl^ferentes às L1 e L2 de M. scutellarís a um
BLASTn com a s sequências r SALL1 de Drosophila . clone de DNAhumano simila P
Em Drosophila esse gene codifica para um domínio protéico com estrutura característico de zinc finger (KOHLHASE etal, 1999) eé requerido para definição de estruturas antero-posteriores durante a embriogênese (JUNGENS, 1988 apud
BUCK et al, 2001). Em humanos, o gene salll está localizado em 16q 12.1 e sua mutação provoca a síndrome de Townes-Brocks e em camundongos, um homologo de sa/11 tem expressão durante o início da embriogênese e, de certo modo, afeta as mesmas estruturasdetectadasem humanos (BUCK ef al, 2001).
Em camundongos, sal/1 iocaliza-se em regiões heterocromáticas
(NETZER et al2001). O fato de, em camundongos esse gene estar localizadoem
regiões heterocromáticas nos faz sugerir, para Melipona scutellaris, assim como para outras espécies de Melipona, um papel fundamental para um gene com
identidade com o gene salH.
Em várias espécies de Melipona, a heterocromatina ocupa praticamente
toda a extensão de todos os cromossomos (ROCHA & POMPOLO, 1998; ROCHA
ef al, 2002). Para essas espécies, um gene que codifica para um produto similar ao SALL1, torna-se forte candidato a repressor de transcrição, assim como ocorre
„ /MFT7FR et al 2001). A descondensação da em células de mamíferos (NETZhK er ai, /
hp Melioona por técnica desenvolvida em
heterocromatina em cromossomos de M&ipona, p
- • ,w n ' p análise de expressão nessa região, contribuirá
nosso laboratório (Vieira c.p.) e ananse p
para confirmar ou não essa hipótese.
Extrapolando, poderiamos sugerir que o produto de um gene similar a esse, estaria relacionado com a estabilidade do genoma, talvez, via supressão de
transposonsou outro mecanismo.
Sequências em Melipona, sem qualquer identidade com aquelas depositadas em banco de dados foram obtidas nesse estudo e, também, em
anteriores (MACHADO, 2001) e pode ser que representem genes, ainda nao
descritos. Outras pesquisas ebuscas responderão isso.
■ - nrnrre em um animal édirigida pelo "ligar” e “desligar” A diferenciação que ocorre em um a
. m ip pqfão ativos em uma célula, é gerada a
de genes e, dependendo dos genes q
,.r„ oroaramas de desenvolvimento diferença entre um tipo celular e outro. Os progra
rpqnostas que se mantem altamente dependem de cascatas de sinais e de respostas q
„ ■ um ponto importante da pesqutsa biologia e
conservadas no reino animal, um p
desvendar esses programas (STRACHAN & READ- 200 )
4-CONCLUSÃO geral
Os resultados obtidos nesseestudo permitem concluir que:
' A técnica DDRT-PCR foieficientepara adetecção de diferentes transcritos
durante o desenvolvimento e em adultos de Melipona scutellaris.
x M-rtia-APOõ permitiu verificar identidade de s A combinação dos primers HT
. com um domínio protéico de tiorredoxina
uma sequência de M. scutella
dissulfeto redutase de Clostridium sporogenes.
uT-i-ia OPA16 mostrou identidade de uma
' A combinação dos primers HT11G-0M
n salH de Drosophila. sequência de M. scutellariscom 9
nrímers para as quais não houve
As sequências obtidas com dados oodem ser
-tôncias depositadas em banco de dados, podem ser alinhamento com sequen
talvez específicas de Melipona.
sequências novas e, talve ,
os fragmentos obtidos nesse trabalho e que ' Há boas chances de que íevgnjes para o desenvolvimento pós-
mostraram similaridade, sejam próxjmOs a regiões de
embrionário, assim como a exp
tinira de Melipona.
elevada condensaçãocrom
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PROTOCOLOS
ANEXO I
EXTRAÇÃO DE RNA (TRIZOL)
1. Maceraro tecido em800pl de trizol/50 a 100 mg detecido,vortex, 30° c/5min 2. Adicionar 0,2 ml de clorofôrmio/ml de Trizol, vortex/15seg, 30°C/2min
3. Centrifugar 12000g/15min a 40 C
4. Transferir a fase aquosa para eppendorf. Adicionar 0,5 ml de isopropanol/ml de Trizol. Misturar, incubar em temperaturaambiente)
5. Centrifugar 12000g/1Omin a 4° C
6. Lavar o pellet com etanol 75% (1 ml de etanol 75%/ ml de Trizol),
centrifugando a 7500g/5 min a 40 C
7. Secar o pellet ao ar
8. Ressuspender em H2O/DEPC
ANEXO II - Remoção Do DNA Cromossomal
DIGESTÃO COM DNAse I (RNase Free)
RNA ~10pg---
Tp1Ox p/1x ---
RNAsin 12U---
DNAse I 1U---
Volume Final ---
Incubar 20 min a Temp. ambiente
Adicionar 1 plde EDTA 25 mM
Incubar 65° C/10 min. colocarno gelo
Fazerextração fenólíca:
— p.1 — 4f.il Ml “ |_ll 20f.il Extração Fenólíca
Adicionar H2O/ DEPC para 200pl--- pl
Adicionar 200pl de clorofane (fenol/cloroformio/alcool isoamilico-25:24:1) vortex/1 min, misturar (manualmente)/5min. centrifugar 14000rpm/5min.
Trasferir a fase aquosa para outro eppendorf contendo 200pl de
cloroformio/alcool isoamílico (24:1 - clorofit) vortex /1 min, misturar
(manualmente)/5min. centrifugar 14000rpmramin.
Transferir a fase aquosa para outro eppendorf, Adicionar o,1 volume de
acetato de sódio 3M ( PH 5,2) 20pl, misturar, adicionar 400pl de etanoi 100% . o 90° 0.12 horas ou overnight.
gelado, misturar. Incubara 2
Centrifugar 14000rpm/30min a 4 C
Remover o sobrenadante. Adicionar o mesmo voiume antenor de etanoi 70% gelado(BOOgi). centrifugar 14000rpm/15 min a 4' C
Remover o sobrenadante
o rnssusoender em20 plde H2o/DEPC
Secar ao are ressuspenu
Dosarem ABSe e ver a integridade