Perfil miRNAs

Para identificar vias epigeneticamente moduladas em pacientes com complicações crônicas microvasculares, o perfil sérico de miRNAs foi comparado entre pacientes com DM1 com todas as complicações microvasculares versus pacientes sem essas complicações e 21 miRNAs diferencialmente expressos foram identificados de um total de 377 miRNAs avaliados.

Um dos primeiros miRNAs associados com as complicações diabéticas na literatura foi o miR-126-3p. Menores concentrações deste miRNA foram encontradas no soro de pacientes com DM1 com uma ou mais complicação micro/macrovascular (87). O miR-126 é altamente enriquecido nas células endoteliais e desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase endotelial e da integridade vascular (105). Além disso, o miR-126-3p é o miRNA mais abundante nos corpos apoptóticos endoteliais e regula a capacidade de resposta ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), por meio da repressão de dois reguladores negativos da via do VEGF: a proteína sprouty relacionada SPRED1 e a segunda subunidade reguladora da cinase do fosfoinositol-3 (PIK3R2 / p85-β), conferindo proteção vascular de maneira parácrina (106).

No nosso trabalho, o miR-126-5p (terceiro menor valor de P entre os dois grupos avaliados) foi encontrado em maiores concentrações nos pacientes com DM1 apresentando todas as complicações microvasculares estudadas. Esse resultado sugere que a fita do pré-miRNA da qual se origina o miRNA maduro pode influenciar na atuação epigénetica; em estudos em câncer, já foram demonstrados efeitos opostos de miRNAs maduros originados de fitas diferentes do mesmo pré-miRNA (66).

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O miR-126-5p é secretado pelas células endoteliais e está envolvido na proliferação das células musculares lisas vasculares. Em pacientes com doença arterial periférica, observou-se aumento da expressão sérica deste miRNA, que se associou com a presença de placas ateroscleróticas (107). Estudos experimentais mostram que essa fita do miRNA 126 é expressa principalmente em células endoteliais de artérias lesadas e tem como um dos principais alvos o DLK1, que impede a proliferação das células endoteliais e participa da aterosclerose (108).

Sabe-se que a seleção de um miRNA maduro (braço 3p ou 5p) pode variar entre diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento. Ainda, que as mudanças na escolha do braço podem ser muito significativas, visto que loci homológos de miRNA podem desempenhar funções discrepantes apenas por apresentarem um padrão de expressão diferencial de um dos dois braços do miRNA (3p e/ou 5p)(66).

Na validação, o aumento da expressão do miR-126-5p não se confirmou nos portadores de DM1 com complicações microvasculares. Aventamos a possibilidade deste miRNA estar mais intimamente relacionado com a presença da doença cardiovascular, que não foi avaliada no presente trabalho. Li e cols. propuseram que o miR-126-5p é um potencial fator preditivo independente para a gravidade da DCV (109).

O hsa-miR-518d-3p foi o miRNA com diferença mais significante entre os dois grupos de pacientes com DM1, e a expressão diferencial foi confirmada no experimento de validação, no qual o grupo apresentando as complicações microvasculares apresentou maior expressão sérica deste miRNA. Um importante alvo deste miRNA são os receptores ativados por proliferador de peroxissoma alfa (PPARα)(60).

O PPARα atua como receptor nuclear da família dos fatores de transcrição e desempenha um papel crítico na homeostasia lipídica e na inflamação (110). Estudos

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prévios já demonstraram que o PPARα está significantemente diminuído na retina de modelos experimentais de DM1 e DM2, e o knockout de PPARα piorou a RD. Além disso, o PPARα mostrou efeitos protetores contra a inflamação endotelial induzida por hiperglicemia e contra a apoptose das células retinianas, por meio do bloqueio da via do NfkB e da melhora do estresse oxidativo na retina (111-113). O mecanismo para a redução da expressão de PPARα na retina diabética, no entanto, ainda não está esclarecido, e o miR-518d-3p é um candidato, uma vez que todos os pacientes no grupo com complicações apresentavam a forma grave de RD. Estudos in vitro, demonstraram que em células do epitélio da retina, há uma correlação entre o aumento de estresse oxidativo e a expressão do miR-518d-3p (114). É interessante mencionar que há estudos que sugerem uma menor incidência de RD em pacientes expostos aos fibratos, que são agonistas do PPARα, em comparação aos não expostos (115-117).

Em 2017, Wan e cols. mostraram que o miR-34a-5p (segundo menor valor de P entre os dois grupos avaliados) está relacionado ao estado de estresse oxidativo intracelular e envolvido na via de sinalização dependente do p53. Em um estudo que usou linhagens de hepatócitos, observou-se que a medida que aumentava a concentração de H2O2, aumentava a expressão deste miRNA (118). Levantamos a hipótese que o hsa-

miR-34a-5p esteja refletindo o maior estresse oxidativo na nossa população com complicação microvascular, já que esse é o elo celular entre todas as complicações do DM, de acordo com a hipótese de Browlee (4).

Um importante alvo do miR-34a-5p é a Notch-1, uma proteína transmembrana que, quando ativada em modelos experimentais, desencadeia uma cascata que leva à desdiferenciação dos podócitos, contribuindo para o desenvolvimento da DRD (119). Estudos demonstram que a maior expressão do miR-34a-5p poderia inibir o desenvolvimento desta complicação diabética (120).

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Entretanto, além da Notch-1, o miR-34a-5p também tem como alvo a sirtuína-1 (SIRT1), uma histona desacetilase dependente de NAD, que tem função principalmente anti-inflamatória e antioxidante. Um estudo recentemente publicado por nosso grupo demonstrou menor expressão de SIRT1 em células linfomononucleares periféricas de pacientes com DM1 com complicações microvasculares (121). O aumento da expressão sérica do miR-34a-5p nesta mesma população poderia sugerir que este miRNA mediasse a diminuição da SIRT1. Contudo, a expressão sérica aumentada deste miRNA não se confirmou na fase de validação.

Outro miRNA que se mostrou mais expresso no soro dos pacientes com complicações microvasculares (mas que não se confirmou na fase de validação) e que também tem como alvo a SIRT1 é o miR-92a. Já foi demonstrado que a expressão sérica do miR-92a-5p é inversamente correlacionada com a TFG em pacientes com doença renal crônica (121).

O miR-425-5p (quarto menor valor de P entre os dois grupos avaliados no perfil sérico) também não teve sua maior expressão sérica confirmada no experimento de validação dos dados. Na literatura, há 33 artigos associando o miR-425-5p com a agressividade de neoplasias, principalmente com o potencial metastático em câncer gástrico e em carcinoma hepatocelular, sendo que a expressão deste miRNA tem se mostrado importante no prognóstico dessas doenças (122, 123).

No grupo com todas as complicações diabéticas selecionado para análise do perfil sérico de miRNAs, observou-se a maior expressão do miRNA-130a-3p. Em um estudo já publicado, o aumento da expressão deste miRNA foi encontrado na urina de pacientes com DRD, em comparação a pacientes sem DRD (77).

O miR-618 foi o quinto com menor valor de P entre os 21 miRNAs mais expressos no grupo com complicações microvasculares e essa maior expressão foi

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confirmada na fase de validação. O presente estudo é o primeiro a associar a expressão do miR-618 a presença de complicações diabéticas. Dentre os mRNAs-alvo deste miRNA está a TXNIP, que interfere com a atividade antioxidante da tiorredoxina e cuja menor expressão foi observada em células linfomononucleares periféricas de DM1 com complicações microvasculares quando comparados com aqueles sem complicações (dados não mostrados(124). É possível que a maior expressão deste miRNA seja um mecanismo compensatório para reduzir a expressão da TXNIP, sabidamente aumentada em situações de hiperglicemia crônica (125).

6.2. Polimorfismos

Na busca por variantes genéticas que pudessem predispor a maiores alterações epigenéticas frente a desarranjos metabólicos semelhantes, foram selecionados SNPs em dois genes que codificam proteínas que atuam nas modificações epigenéticas.

Este é um dos raros estudos que evidencia a associação de um SNP em um gene que codifica uma proteína que participa de uma modificação epigenética com uma complicação crônica do DM. A presença do alelo raro C do rs11085721, localizado no gene DNMT1, mostrou-se de risco para a NAC no sexo feminino. Este SNP está localizado no segundo íntron do gene DNMT1 e já foi associado a uma maior predisposição para a leucemia linfoblástica aguda em crianças. Não se sabe se ele, por ser um “tagSNP” em desequilíbrio de ligação com outros SNPs no mesmo gene, apenas reflita o efeito de outros SNPs funcionais ou se ele é a variante causal, pois ainda não há estudos funcionais para SNPs neste gene (126).

Na literatura há evidências de aumento da ocorrência da metilação do DNA e também da expressão da DNMT1 em modelos experimentais e humanos de DM2

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quando comparados ao grupo controle sem DM, mas pouco se sabe acerca das complicações crônicas do DM (48).

Não encontramos estudos na literatura que tenham avaliado a associação de SNPs no DMNT1 com a presença de complicações crônicas microvasculares do DM. No entanto, já foi observado que o grau de metilação do DNA, alteração epigenética em que a DMNT1 também participa, está associado com a gravidade da RD em pacientes com DM2 (52). Por outro lado, a DRD já foi associada tanto com a hipometilação de genes alvos quanto com a hipermetilação gênomica (53, 127). No presente estudo, não foram encontradas associações de SNPs no DMNT1 nem com a RD e nem com a DRD.

Os polimorfismos da SIRT1 não se mostraram associados com nenhuma das complicações microvasculares estudadas na nossa população de DM1. Maeda e cols. avaliaram se algum dos oito polimorfismos da SIRT1, que cobriria 100% da variação alélica deste gene, estaria associado com a presença de DRD em uma população japonesa com DM2, porém este estudo encontrou apenas uma forte associação nominal (37).

A associação encontrada entre o SNP rs11085721 no gene DNMT1 e a presença de NAC na população de pacientes do sexo feminino deve ser interpretada no contexto das limitações de um estudo transversal e investigações adicionais devem ser realizadas em uma casuística maior. No presente momento, não temos explicação para o achado da associação ter sido observada apenas em mulheres e estar restrita a NAC, não tendo sido observada nas demais complicações microvasculares. Essa associação, se confirmada, corrobora a hipótese de que a “genética da epigenética” também module o desenvolvimento e/ou progressão das complicações microvasculares.

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1. O perfil de miRNAs séricos difere entre pacientes com DM1 de longa data com e sem complicações microvasculares. De um total de 377 miRNAs avaliados, 21 apresentarem-se mais expressos no grupo com complicações e dentre os cinco miRNAs validados, dois apresentaram-se mais expresso neste grupo, o hsa-miR-518d-3p e o hsa- miR-618.

2. Na população de pacientes com DM1 avaliada, não houve associação das complicações microvasculares com polimorfismos de um único nucleotídeo no gene que codifica a sirtuína-1. O polimorfismo rs11085721 no gene DNMT1, que codifica a enzima DNA metiltransferase 1, associou-se à presença de NAC em pacientes do sexo feminino.

39 39 9. ANEXOS

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