6.2 PERSPECTIVAS DE DESENVOLVIMENTOS FUTUROS

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But du travail & Stratégie générale.

L’activation de la cascade de l’AMPc par la TSH stimule la progression des thyrocytes de chien dans le cycle cellulaire. La participation de la PKA dans l’effet mitogénique de la TSH a été clairement démontrée, lors d’études antérieures réalisées au laboratoire, par l’utilisation d’analogues de l’AMPc [173] ou d’un inhibiteur spécifique de la PKA [49]. L’entrée en phase de synthèse d’ADN n’est toutefois observée qu’après une période préréplicative d’environ 18 à 20 heures, pendant laquelle les cellules subissent de nombreuses modifications de l’expression génique. L’identité des facteurs de transcription impliqués dans ces régulations n’a cependant pas encore été établie. Nous avons donc entrepris cette étude dans le but d’investiguer le rôle de facteurs de transcription dépendant de l’AMPc dans la prolifération des thyrocytes de chien induite par la TSH. Les facteurs de transcription CREB et CREM ont été décrits comme les médiateurs de nombreux effets transcriptionnels de la cascade de l’AMPc. Des travaux réalisés dans différents systèmes cellulaires ont montré que ces facteurs de transcription pouvaient être régulés par la cascade de l’AMPc au niveau de leur expression (CREM) ou au niveau de leur activité par un mécanisme de phosphorylation impliquant la PKA (CREB et CREM).

Nous avons entamé ce travail par l’analyse de la régulation de l’expression des facteurs de transcription CREM dans les thyrocytes de chien lors de l’activation de la cascade de l’AMPc, par la TSH ou la forskoline. Cette étude a été réalisée à deux niveaux, d’une part, par des expériences de protection à la RNAse afin de pouvoir étudier l’expression des différents ARNm CREM générés par épissages alternatifs et, d’autre part, par des expériences d’immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps anti-CREM obtenus suite à l’immunisation de lapins avec une protéine recombinante. Nous nous sommes également intéressés à l’effet d’autres voies de signalisation qui induisent la prolifération des thyrocytes de chien et avons donc examiné l’expression des facteurs de transcription CREM au cours de stimulations par l’EGF, l’HGF et le TPA.

Nous avons par la suite mené une étude similaire dans un modèle de cellules thyroïdiennes d’origine porcine, qui, contrairement aux thyrocytes de chien, présentent la particularité de ne pas proliférer lorsqu’elles sont stimulées par la TSH. L’objectif de ces expériences était de mettre en évidence un lien direct entre la régulation de l’expression des facteurs de transcription CREM et l’effet mitogénique de la TSH dans les cellules thyroïdiennes.

Par ailleurs, nous avons également étudié la modulation du degré de phosphorylation des faeteurs de transcription CREB et CREM dans les thyrocytes de chien en réponse à l’activation de la cascade de l’AMPc. Pour les expériences d’immunofluorescence indirecte qui ont été réalisées dans ce cadre, nous avons bénéficié de l’existence d’un anticorps

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capable de reconnaître spécifiquement ces facteurs de transcription lorsqu’ils sont phosphorylés sur le résidu sérine du site consensus de phosphorylation de la PKA.

L’étude proprement dite du rôle des facteurs de transcription CREE et CREM dans l’effet mitogénique de la TSH a été abordée par des expériences de surexpression dans les thyrocytes de chien. Pour ce faire, nous avons tout d’abord procédé à la mise au point d’une nouvelle méthode de transfection, basée sur l’utilisation de lipides cationiques. Dans un premier temps, nous avons envisagé de surexprimer des isoformes CREM à effet antagoniste (CREM a ou ICER ly), afin de bloquer la transactivation par les facteurs de transcription CREE et CREM endogènes. Par la suite, nous avons également étudié l’effet de la surexpression d’isoformes CREM activatrices (CREM x et CREM xla). Enfin, nous nous sommes intéressés à l’effet d’isoformes ICER ly et CREM xla mutées, dans lesquelles certains acides aminés ont été remplacés, de manière à interférer avec leur capacité à lier l’ADN et/ou à dimériser. Des vecteurs recombinants codant pour chacune de ces isoformes ont donc été construits et transfectés dans les thyrocytes de chien. La capacité de ces cellules à proliférer en réponse à la TSH a été évaluée par incorporation de bromodéoxyuridine dans le noyau des cellules en phase de synthèse d’ADN. L’expression du transgène et l’incorporation de bromodéoxyuridine ont été détectées de manière simultanée dans la population de thyrocytes par un double marquage en immunofluorescence indirecte.

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Méthodologie.

1. Culture de cellules thyroïdiennes [142,143].

Le tissu thyroïdien, fraîchement prélevé, est nettoyé et émincé, puis incubé à 39°C dans un mélange de collagénase (120 U/ml) et de DNAse I (100 U/ml) jusqu’à obtention d’une suspension de follicules. Après élimination des débris par filtration, les follicules thyroïdiens sont séparés des cellules isolées par trois centrifugations à basse vitesse (2 minutes à lOOx g). A ce stade, 1 pl du culot de follicules équivaut environ à 2 x 10^ cellules. Pour l’extraction d’ARN, les follicules sont ensemencés dans des boîtes de Pétri de 92 mm de diamètre, à raison de 2 x 10^ cellules par boîte. Pour les expériences d’immunofluorescence indirecte, les follicules sont ensemencés dans des boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre, à raison de 1 x 10^ cellules par boîte. Les cellules thyroïdiennes sont cultivées dans un milieu composé de DMEM, Ham’s F12 et MCDB 104 (2:1:1 en volume), complémenté en insuline (5 pg/ml), pyruvate de sodium (2 mM), acide ascorbique (40 pg/ml), pénicilline (100 U/ml), streptomycine (100 pg/ml) et fungizone (2.5 pg/ml); elles sont maintenues à 37°C dans un incubateur saturé en eau et contenant 5% de CO2. Quatre jours après l’ensemencement, les thyrocytes sont stimulés pour des temps variables par la TSH (1 mU/ml), la forskoline (10 pM), TEGF (25 ng/ml), THGF (50 ng/ml) ou le TPA (10 ng/ml). Dans certaines expériences, l’insuline (5 pg/ml) a été supprimée du milieu de base et rajoutée au quatrième jour comme stimulant. Pour les stimulations prolongées par la TSH, les cellules sont maintenues pendant 2 jours dans le milieu de base et sont ensuite cultivées dans un milieu complémenté en TSH (1 mU/ml).

2. Transfection de thyrocytes de chien et mesure de la prolifération cellulaire.

Les follicules thyroïdiens sont ensemencés dans des boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre, à raison de 1 x 10^ cellules par boîte, et cultivés dans le milieu de base. Trois jours plus tard, lorsque les follicules sont bien étalés, les cellules sont transfectées par la méthode du FuGENE 6 (Boehringer Mannheim, Allemagne). L’ADN plasmidique (2 pg) et le FuGENE 6 (6 pl) sont tout d’abord incubés dans 75 pi de DMEM pendant 15 minutes à température ambiante. Les complexes ADN/FuGENE 6 sont ensuite appliqués sur les cellules. Celles-ci sont cultivées à 37°C en présence du mélange ADN/FuGENE 6 pendant 24 heures dans le milieu de base. Après cette incubation, le milieu de culture est remplacé par du milieu frais complémenté en TSH (1 mU/ml). A partir de ce moment, les cellules sont encore incubées pendant 48 heures. Durant les dernières 24 heures, nous ajoutons dans le milieu de culture

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un mélange de 8-bromodéoxyuridine (1 x lO"' M) et de fluorodéoxycytidine (2 x 10'^ M), afin d’évaluer l’entrée des cellules en phase de synthèse d’ADN.

3. Transfection de cellules COS-7 et immunodétection.

Les cultures de cellules COS-7 sont entretenues dans un milieu DMEM complémenté en sémm foetal bovin (10%), pymvate de sodium (2 mM), pénicilline (100 U/ml), streptomycine (100 pg/ml) et fiingizone (2.5 pg/ml); les cellules sont cultivées à 37°C dans un incubateur saturé en eau et contenant 5% de CO2. Au moment de l’expérience, les cellules à confluence sont trypsinisées et ensemencées dans des boîtes de Pétri de 35 mm de diamètre, à raison de 2 x 10^ cellules par boîte. Le lendemain, elles sont transfectées avec 1 pg d’ADN plasmidique par la méthode du diéthylaminoéthyl-dextran [170], associée à un choc au diméthylsulfoxyde. Les cellules sont récoltées 48 heures après la transfection et lysées dans le tampon Laemmli. Le extraits protéiques des cellules COS, bouillis pendant 5 minutes, sont séparés dans un gel SDS-PAGE (12.5%) puis transférés sur membrane de nitrocellulose par électroélution. Les protéines d’intérêt sont détectées à l’aide d’anticorps spécifiques (anticorps anti-CREM, 1/1000; Ab 244 anti-CREB, 1/250) et révélées par la méthode de chimioluminescence.

4. Purifîcation d’ARN total [30].

En fin de culture, les cellules sont récoltées dans une solution d’homogénéisation (thiocyanate de guanidine 4 M/citrate de sodium 25 mM pH 7.0), à raison de 1.9 ml pour 4 boîtes de 92 mm de diamètre. A cet homogénat, sont rajoutés 840 mg de chlorure de césium. Cette solution est déposée délicatement sur un coussin de 1.2 ml de chlorure de césium 5.7 M/EDTA 0.1 M. L’ARN est séparé de l’ADN et des protéines par centrifugation à 130000x g pendant 17 heures à 15°C (rotor Beckman SW56). L’ARN, resuspendu dans une solution SDS 1%/NaCl 0.3 M, est ensuite traité à la protéinase K (60 pg/ml; 30 minutes à 37°C) et purifié par extractions successives au phénol, chloroforme et éther. Après précipitation à l’éthanol et resuspension dans de l’eau, la préparation d’ARN est dosée par spectrophotométrie.

5. Purification de la protéine recombinante ICER ly et immunisation des lapins.

L’ADNc codant pour l’isoforme ICER ly a été sous-cloné dans le vecteur d’expression procaryote pMal-cRI, entre les sites de restriction BamHI et HindlII, et cette construction a

Mini Prep Cell

Elution hujfer

GW tube To peristaltic pump and fraction collector Protein bands Lowcr elcctrophorciii bujfer

Patented elution chamber Elution collection tube Vpper

electrophoresis buffer

Figure n°13 : Schéma de l’appareil “Mini Prep Cell” (Bio Rad). Les protéines sont séparées, en fonction de leur poids moléculaire, par électrophorèse au travers d’un boudin d’acrylamide et récoltées à la sortie du gel.

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été transformée dans des bactéries E.coli C600. Nous avons vérifié par séquençage que l’ADNc d’intérêt avait bien été inséré en phase avec la séquence de la MBP (Maltose- Finding Protein). La protéine recombinante MBP/ICER ly est produite par induction à l’IPTG (0.3 mM; 3 heures à 37°C) d’une culture bactérienne (250 ml), préalablement amenée à une densité optique de 0.6 à 600 nm. Après induction, la suspension de bactéries est centrifugée et les bactéries sont lysées dans le tampon Laemmli (15 ml). La protéine de fusion MBP/ICER ly est purifiée par séparation électrophorétique des protéines du lysat bactérien sur gel SDS-PAGE, à l’aide de l’appareillage illustré dans la figure 13. La séparation se fait au travers d’un boudin d’acrylamide (9%), de 3.7 cm de diamètre et 6 cm de hauteur. La solution d’électrophorèse est composée de Tris 25 mM, glycine 200 mM et SDS 0.1%. La migration se fait sous ampérage constant de 50 mA. Afin d’éviter une trop grande différence de conductivité entre la solution de migration et la solution d’élution, les protéines sont récoltées à la sortie du gel dans une solution Tris 25 mM/glycine 200 mM, à un débit de 0.4 ml/min, puis dialysées contre une solution Tris 20mM/EDTA 1 mM/NaCl 200 mM à pH 7.5. La protéine de fusion MBP/ICER ly, prépurifiée de cette manière, est alors clivée par la protéase “facteur Xa” (1% en poids par rapport à la quantité de protéine de fusion, 16 heures à température ambiante). La protéine ICER ly, issue de ce clivage, est purifiée selon le même principe de boudin d’acrylamide (15%, 2.8 cm de diamètre et 6 cm de hauteur). Après élution, la préparation de protéine ICER ly est dialysée contre une solution de NaCl 9%o et dosée par la méthode de Bradford [28]. Trois injections intradermiques de cette préparation protéique (environ 250 pg), mélangée à de l’adjuvant de Freund (1:1 en volume), ont été pratiquées à deux lapins à trois semaines d’intervalle. Du sérum a été prélevé à chacun de ces lapins avant l’immunisation et 15 jours après la dernière injection.

Pour les autres techniques expérimentales utilisées au cours de ce travail, nous faisons référence aux différents articles inclus en annexe, dans lesquels ces méthodes ont été détaillées :

• RT-PCR et protection à la RNAse : article n°l;

• cytofluorimétrie (FACS) : article n°2;

• immunofluorescence indirecte : article n°3;

, O

Chien MTMDTMESQQDGSVTDSVAENESAHMQNQTGQNSIPTLTQVSVAGSGTGRGSPAVTLVQL 60 Homme ...E.V.. .H...I.A.LT.SK. ..V.T....I.. .A.A.C.ELR. ..R... 60 Souris . . .E.V...R. . .R. . . .HS . . . . - - . . . . I. V. . . A... 58 PSGOTVHVOGIIOTPOPSVIOSPOIOTVOVATIAETDESAESEGVIDSHKRREIL.SRRPS 120 ... I. . . .V... W. . . .SE.H... A...120 ... Q. . .V. . . .H...D. .D. . -... 117 YRKILNELSSDVPGVPKIEEEKSEEEGTPPNIATMAVPTSIYQTSTGQYIAIAQGGTIQI 180 ...R... S... 180 ...I... 177 SNPGSDGVQGLQALTMTNSGAPPPGATIVQYAAQSADGTQQFFVPGSQVWQDEETELAP 24 0 ... 232 ...D... 237 SHMAAATGDMPTYQIRAPTTALPQGWMAASPGSLHSPQQLAEEA'I^KRELRLMKNREAAl 300 ...A... 288 297 IrECRRKKKEYVKCLENRVAVLENONKTLIEELKALKDLYCHKAEI 344 ... V. 332 ... 341 lEAAKECRRRKKEYVKCLESRVAVLEVQNKKLIEELETLKDICSPKTD-1 (344) ...Y (333) ...- (341)

Figure n°14 : Comparaison des séquences en acides aminés des facteurs de transcription CREM de chien, d’homme et de souris.

Les domaines de liaison à l’ADN sont encadrés; la position des acides aminés constituant le deuxième domaine de liaison à l’ADN est indiquée entre parenthèses. Les régions riches en glutamines sont soulignées par un trait plein et le site consensus de phosphorylation de la PKA en trait pointillé. Les points correspondent à des acides aminés conservés et les tirets aux acides aminés absents.

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Résultats.

I - Obtention et mise au point des outils de travail.

I.l - Clonage d’ADNc codant pour différentes isoformes CREM.

La stratégie générale envisagée au début de ce travail faisait appel, d’une part, à des techniques permettant l’analyse de l’expression d’ARNm (protection à la RNAse) et d’autre part, à des méthodes de surexpression (transfection) destinées à des études fonctiormelles. Nous avons donc abordé ce travail par le clonage dans l’espèce canine et le séquençage d’un ADNc codant pour l’isoforme CREM la plus longue. Le variant d’épissage CREM xa a été isolé à partir d’une préparation d’ARN total de thyroïde de chien, par la méthode de transcription inverse combinée à la réaction de polymérisation en chaîne, à l’aide de deux couples d’amorces choisies sur base de la séquence de souris [57,58] et permettant l’amplification de deux fragments d’ADN chevauchants. L’ADNc correspondant (1460 pb) présente une phase ouverte de lecture de 344 acides aminés (figure 14). La comparaison de la séquence CREM de chien avec ses orthologues murin [57,58]et humain [105] a révélé une très grande conservation, respectivement 94.5 et 91% d’identité en acides aminés. En réalité, les divergences de séquences sont confinées dans la partie N-terminale de la protéine. La deuxième région riche en glutamines ainsi que les domaines de liaison à l’ADN sont en revanche parfaitement conservés, ce qui témoigne de la fonction essentielle de ces domaines protéiques dans le processus de transactivation. Par ailleurs, le domaine régulateur KID est également bien conservé. Ces données ont été rapportées dans l’article intitulé “Dog CREM transcription factors : cloning, tissue distribution and identification of new isoforms.” (article n° 1, en annexe). Au cours de cette étude, nous avons également été amenés à construire des vecteurs d’expression codant pour d’autres isoformes CREM (CREM a, CREM x, CREM xla et ICER ly). Les ADNc correspondants ont été clonés selon une procédure similaire. A cette occasion, nous avons pu mettre en évidence de nouveaux variants d’épissage, caractérisés par l’élimination de l’exon X (voir figure 5). Cependant, comme nous ne les avons pas étudiés de manière plus approfondie, ils ne seront pas davantage détaillés et ne sont que brièvement décrits dans l’article n°l inclus en annexe.

1.2 - Construction de sondes pour la méthode de protection à la RNAse.

Une partie importante de ce travail a été consacrée à l’étude de l’expression des facteurs de transcription CREM dans les cellules thyroïdiennes soumises à différentes conditions de stimulation. Dans un premier temps, nous avions abordé cette question par la technique de Northern blotting. Cependant, aucun résultat n’a pu être obtenu par cette méthode, ceci en

(a) ^{exon 1 exon 2 exon 3}

sonde

...iiTiilï■;i■■■■ iïiVi iViTi ; vi iiïi... r

...

Q, KID y DBDI DBDII

1 . . .iKvws nr * ~i jwwww I if////irTT! ! : ! i 1=1 E=3^^ sonde 1 sonde2 cz ^ ---—y s(»\de3

solde 1 sonde 2 solde 3

CREM a 241 224 279 CREM P 241 202 166 CREM Y 241 166 166 CREM T 327 287 166 CREM Tl 265 202 166 CREMt2 303 287 166 CREM Ta 327 309 279 ICERI - 224 279 ICERIy - 188 304 ICER II - 202 166 ICERIIy - 166 191

Figure n°15 : Application de la méthode de protection à la RNAse à l’analyse de l’expression d’ARNm issus d’épissages alternatifs.

(a) principe de la méthode. La sonde, qui chevauche plusieurs exons, peut former des hybrides de taille différente en fonction de l’organisation exonique de chaque ARNm. (b) position des sondes choisies pour l’analyse de l’expression des ARNm CREM et taille attendue pour les différents hybrides (pb).

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raison du faible niveau d’expression des ARNm CREM dans les cellules. Nous avons dès lors décidé d’utiliser la méthode de protection à la RNAse [108,200]. Cette technique est basée sur la formation d’un hybride spécifique entre l’ARNm d’intérêt et une sonde ribonucléotidique de séquence complémentaire (figure 15a). Les fragments de l’ARNm et de la sonde restés non-hybridés sont ensuite éliminés par des ribonucléases. Cette méthode, plus sensible que le Northern blotting, est aussi particulièrement adaptée à l’analyse d’ARNm issus d’épissages alternatifs. La taille de l’hybride reflète en effet l’arrangement des exons dans l’ARNm (figure 15a). Afin de discriminer les différentes isoformes CREM, nous avons réalisé les expériences de protection à la RNAse à l’aide de trois sondes, réparties sur l’ensemble des exons (figure 15b). Un travail préalable a donc consisté à construire ces sondes, par amplification des différents fragments à l’aide de la réaction de polymérisation en chaîne. Les études d’expression ayant été réalisées dans des thyrocytes de chien mais aussi dans des cellules thyroïdiennes de porc, il nous a fallu préparer des sondes pour chacune de ces espèces; le principe même de la méthode de protection à la RNAse impose en effet une homologie parfaite entre la séquence de la sonde et celle de l’ARNm. La position des trois sondes par rapport aux différents exons du gène CREM (figure 15b) s’inscrit dans la logique suivante. La sonde n°l, dont la séquence chevauche les exons C à G, permet d’étudier spécifiquement l’expression des ARNm synthétisés à partir du promoteur P, du gène CREM, puisque les transcrits ICER ne sont pas détectables par cette sonde. A l’inverse, les sondes n°2 et 3 ont été construites de manière à examiner plus particulièrement l’expression des ARNm ICER. La compilation des données obtenues avec chaque sonde permet donc d’analyser l’expression des différentes isoformes CREM. Cette méthode a été initialement appliquée à l’étude de la distribution tissulaire des isoformes CREM et est décrite dans l’article intitulé “Dog CREM transcription factors ; cloning, tissue distribution and identification of new isoforms.” (article n°l, en annexe).

1.3 - Obtention d’anticorps contre les facteurs de transcription CREM.

Afin de disposer d’anticorps permettant d’étudier l’expression des facteurs de transcription CREM dans les cellules thyroïdiennes, nous avons immunisé des lapins à l’aide d’une protéine recombinante, produite dans un système bactérien. Pour cela, nous avons sous-cloné l’ADNc codant pour l’isoforme ICER ly de chien dans le vecteur d’expression procaryote pMal-cRI. L’expression de cette construction dans la bactérie permet la synthèse d’une protéine de fusion entre la protéine bactérienne MBP et la protéine d’intérêt (ICER ly). Après induction de son expression par l’IPTG, la protéine de fusion MBP/ICER ly est la protéine majoritaire du lysat bactérien (figure 16a). Dans un premier temps, nous avons tenté de purifier la protéine de fusion MBP/ICER ly à partir du lysat bactérien de manière classique, c’est-à-dire en tirant profit de la capacité de la MBP à lier l’amylose. Bien que la fraction soluble du lysat bactérien contienne la majorité de la protéine de fusion MBP/ICER

Figure n°16 : Production dans des bactéries et purification de la protéine recombinante ICER ly. (a) Induction de l’expression de la protéine MBP-ICER ly par l’IPTG

(b) Purification de la protéine MBP-ICER ly par séparation électrophorétique sur Prep Cell

(c) Clivage de la protéine MBP-ICER ly par le facteur Xa et purification de la protéine ICER ly par Prep Cell Les protéines sont mises en évidence par coloration au Bleu de Coomassie, après migration sur gel SDS-PAGE.

anti-CREM

5

anti-CREB

Figure n°17 : Spécificité des anticorps anti-CREM.

Immunodétection d’extraits protéiques de cellules COS transfectées par les vecteurs pcDNA3 (1), ICER ly / pcDNA3 (2), CREM a / pcDNA3 (3), CREB / pRSV (4,5), à l’aide des anticorps anti-CREM (1-4) et anti- CREB (5).

anti-CREM

pcDNA3 ICER ly / pcDNA3 CREM a / pcDNA3

CREB/pRSV

anti-CREM anti-CREB

Figure n°18 : Spécificité des anticorps anti-CREM.

Immunofluorescence indirecte dans des cellules COS transfectées par les vecteurs pcDNA3, ICER ly / pcDNA3, CREM a / pcDNA3 et CREB / pRSV.

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ly, la purification par colonne d’amylose s’est avérée très peu rentable. Une proportion importante de la protéine de fusion MBP/ICER ly passait en effet au travers de la colonne d’amylose sans s’y fixer. Afin d’augmenter le rendement de purification de la protéine MBP/ICER ly, nous avons eu recours à une méthode alternative, basée sur la séparation électrophorétique des protéines du lysat bactérien sur un boudin d’acrylamide (méthode “Prep Cell”; voir figure 13, dans la partie “Méthodologie”). A la sortie du gel, les protéines sont récoltées en fonction de leur poids moléculaire (figure 16b). A l’aide de cette technique, nous avons donc procédé à une prépurification de la protéine MBP/ICER ly, d’un poids moléculaire apparent de 58 kD (figure 16b). Suite à cette première étape de purification, nous avons exploité la présence dans la protéine de fusion MBP/ICER ly d’un site de clivage pour la protéase “facteur Xa”, localisé entre le fragment MBP et la séquence ICER ly. Après