7 – PERSPECTIVAS FUTURAS

Deveria ser implementada uma política de rastreios permanentes da QAI em ambiente hospitalar para salvaguarda da saúde pública, especialmente dos pacientes por muitos deles apresentarem um sistema imunitário debilitado ou serem sujeitos a intervenções invasivas que permitem uma contaminação facilitada do corpo humano pelos microorganismos presentes no ar, levando ao incremento da frequência de infecções nosocomiais.

Em Portugal deveria ser implementada legislação específica para ambiente hospitalar, a par da que já existe noutros países, uma vez que a actual é genérica para edifícios e a concentração máxima de referência para microorganismos no ar é demasiado permissiva para determinados locais no interior de hospitais, especialmente para as salas de cirurgia e locais de internamento de pacientes com sistema imunitário debilitado.

A obrigatoriedade de identificação das bactérias presentes no ar também deveria ser implementada na legislação nacional, pois os riscos para a saúde humana são muito variáveis consoante as espécies em questão e a legislação actual considera todas as bactérias com o mesmo risco ao limitar unicamente a concentração de bactérias totais presentes no ar. A quantificação selectiva de espécies patogénicas com recurso a meios de cultura selectivos ou técnicas moleculares dirigidas a essas espécies poderiam ser uma alternativa mais simples e menos dispendiosa à identificação de todas as bactérias presentes no ar.

Outra área com importância clínica e de saúde pública que deveria ser estudada futuramente em Portugal é a da resistência bacteriana a antibióticos no ambiente hospitalar. Existem evidências do aumento deste fenómeno a nível mundial, devendo ser estudado para permitir uma adequação da terapêutica antimicrobiana prescrita.

A utilização de técnicas moleculares na identificação bacteriana revela muitas vantagens, especialmente a elevada precisão, devendo substituir cada vez mais as técnicas tradicionais no futuro próximo. Estudos recentes têm utilizado técnicas moleculares na identificação e comparação de comunidades de bactérias de vários ambientes e a tendência futura é que estes tipos de estudos alarguem os horizontes para outros ambientes que tradicionalmente não são amostrados, como animais domésticos, utensílios alimentares e superfícies, entre inúmeras possibilidades.

As técnicas moleculares terão também cada vez mais importância na classificação taxonómica de bactérias, havendo ainda espécies novas por descrever mas cuja existência já foi detectada pela existência de sequências de DNA distintas das de espécies conhecidas, e nos estudos filogenéticos, permitindo inferir com elevado rigor a relação entre os taxa. Vários

grupos bacterianos já descritos deveriam ser reavaliados com estas novas técnicas para permitir a correcção das classificações taxonómicas mal aplicadas.

As técnicas moleculares aplicadas na detecção de bactérias serão cada vez mais utilizadas por não serem tão limitadas como as técnicas tradicionais, possibilitando por exemplo uma rápida detecção de contaminação ambiental, o rastreio de estirpes ou linhagens únicas para pesquisa epidemiológica de rotas de contaminação, rápida e precisa identificação de amostras clínicas permitindo uma célere aplicação de terapêutica adequada à espécie em questão e respectiva resistência a antibióticos, e a detecção e identificação de bactérias de cultivo difícil ou impossível.

Figura 1 - Autorização do Conselho de Administração da SESARAM para a realização dos trabalhos da tese de mestrado.

Figura 2 – Ofício da UMa a solicitar a autorização ao Conselho de Administração da SESARAM para a realização dos trabalhos da tese de mestrado. (Ofício de 2009.06.04 mencionado no documento anterior).

Figura 3 – Gráfico de acumulação de OTU por esforço de amostragem, com estimadores de diversidade biológica. São graficados o número de OTU de bactérias no ar interior do HJA pelo núme ro de locais

amostrados, com estimativas do número de OTU presentes. Sobs – dados observados neste trabalho;

Chao1 – Estimador de Chao baseado no número de espécies raras; Chao2 - Estimador de Chao baseado

nos dados de presença/ausência; Jacknife 1 – Estimador de Jacknife baseado em OTU que apenas

aparecem em 1 amostra.

0 5 10 15

Número de locais amostrados 0 50 100 150 200 250 300 N ú m e ro d e O T U s Sobs Chao1 Chao2 Jacknife1

Figura 6 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 9, colónia número 65 (designada como 536 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 7 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 21, colónia número 53 (designada como 537 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 8 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 15, colónia número 51 (designada como 538 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 9 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 3, colónia número 3 (designada como 539 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 10 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 37, colónia número 32 (designada como 541 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não pre sente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 11 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 3, colónia número 45 (designada como 542 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente seque nciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 12 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 29, colónia número 45 (designada como 545 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 13 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 31, colónia número 60 (designada como 546 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 14 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 9, colónia número 40 (designada como 547 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 15 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 30, colónia número 11 (designada como 548 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 16 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 25, colónia número 15 (designada como 549 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 17 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 23, colónia número 14 (designada como 554 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 18 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 25, colónia número 57 (designada como 555 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na b ase de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 19 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 4, colónia número 10 (designada como 556 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C) , e número de acesso no GenBank.

Figura 20 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 33, colónia número 38 (designada como 557 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados

Figura 21 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 9, colónia número 77 (designada como 558 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 22 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 28, colónia número 61 (designada como 559 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 23 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 14, colónia número 10 (designada como 560 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nom e ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 24 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 14, colónia número 15 (designada como 563 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma com pletamente sequenciado (C), e número de

Figura 25 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 35, colónia número 10 (designada como 564 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 26 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 37, colónia número 16 (designada como 565 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dad os nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 27 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 14, colónia número 18 (designada como 566 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e númer o de acesso no GenBank.

Figura 28 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 35, colónia número 73 (designada como 567 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de

Figura 29 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amo stra da placa número 35, colónia número 67 (designada como 571 na figura) e estirpes tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Figura 30 – Árvore filogenética gerada pela base de dados BIBI, com amostra da placa número 29, colónia número 45 (designada como 545 na figura) e estirpes tipo e não tipo de espécies de bactérias próximas. Espécies identificadas com indicação de: nome válido (v), nome ainda não presente na base de dados nomenclatural (?), estirpe tipo (T), estirpe não tipo (i), espécie com genoma completamente sequenciado (C), e número de acesso no GenBank.

Tabela 2 – Dados obtidos durante as amostragens do ar interior e exterior do HJA e resultados laboratoriais do cálculo da concentração de microorganismos no ar. N/A – Não aplicável; Campos vazios indicam ausência de dados.

exterior do HJA com recurso a testes bioquímicos. Não identificado – indica que a bactéria pertence a outro género que não o Staphylococcus sp.

recurso a técnicas moleculares, nomeadamente padrão de RFLP com as enzimas de restrição HhaI e HaeIII e sequenciação do gene 16S rRNA. Campos vazios indicam ausência de dados.

respectiva quantidade de amostras identificadas por sequenciação do gene 16s rRNA, por similaridade de padrão de RFLP ou não identificadas.

respectiva quantidade de amostras identificadas por sequenciação do gene 16s rRNA, por similaridade de padrão de RFLP ou não identificadas.

Tabela 7 – Resultados da identificação das amostras sequenciadas pela base de dados Bio Informatic Bacteria Identification (BIBI). Homologia (N) -número de nucleótidos iguais

entre sequências /número de nucleótidos totais da sequência da amostra; Gaps (N) – número de espaços introduzidos nas sequências para obtenção do melhor alinhamento

possível; Score (bits) – Pontuação atribuída à qualidade do alinhamento. Referências bibliográficas relativas às sinonímias: 1-Sneath (1992), 2-Arenskötter et al (2005), 3-IJSEM (2003), 4-CCUG

Tabela 8 – Resultados da identificação das amostras sequenciada s pela base de dados GenBank do NCBI. Homologia (N) -número de nucleótidos iguais entre sequências

/número de nucleótidos totais da sequência da amostra; Gaps (N) – número de espaços introduzidos nas sequências para obtenção do melhor alinhamento possível; Score