Perspectivas Futuras

O principal objectivo deste trabalho, tal como já foi referido, incidiu em estudos de metabolismo de extracto aquoso de F. vulgare, de modo a testar a sua eventual aplicabilidade na terapêutica da AD. Embora os objectivos propostos tenham sido atingidos com sucesso, ainda muito trabalho há a realizar para a avaliação da biodisponibilidade dos compostos polifenólicos existentes no extracto aquoso de F.

vulgare a nível sistémico e da permeação dos mesmos pela barreira hemato-encefálica. Nesta secção

são propostos alguns estudos que permitirão complementar o trabalho aqui apresentado, melhorando a compreensão dos processos inerentes ao metabolismo dos compostos polifenólicos presentes no extracto aquoso de F. vulgare.

Em primeira instância, devem ser completados os estudos de identificação química do extracto, procedendo-se à recolha por HPLC preparativo do pico 1 e analisando-se o mesmo por espectrometria de massa.

O estudo comparativo que foi realizado com F. vulgare de diferentes origens pode ser complementado, a nível de ensaios metabólicos dos diferentes tipos de sementes e ainda a outras variedades de funcho.

Poderão ser optimizados os ensaios realizados neste trabalho e ainda estudos semelhantes que abordem outras fases metabólicas. A nível intestinal, pode ser analisada a acção esterase da flora intestinal, uma vez que o extracto aquoso de F. vulgare é altamente rico em compostos com ligações éster. Ainda no intestino, devem também ser estudados os processos de transporte dos compostos polifenólicos, nomeadamente, transporte paracelular (passagem de compostos entre as células do epitélio intestinal) ou através de transportadores de membrana. O transporte paracelular pode ser estudado através de sistemas experimentais criados propositadamente para este fim enquanto o transporte através de receptores de membrana necessita de monocamadas intestinais (como as células Caco-2 utilizadas neste trabalho).

Estando o fígado envolvido na metabolização de compostos, devem também ser estudados processos metabólicos, além da glucuronidação, como por exemplo, sulfatação e O-metilação. Estes estudos podem ser realizados de modo semelhante ao do ensaio de glucuronidação por homogenato de fígado de ratinho, apresentado em 4.1 do capítulo III, recorrendo ao homogenato como fonte enzimática, ao extracto aquoso de F. vulgare como substrato e apenas adicionando o cofactor das reacções, sendo estas seguidas por HPLC.

Após metabolismo hepático, podem ser realizados estudos de biodisponibilidade plasmática dos compostos existentes no extracto aquoso de F. vulgare, administrando, para isso, extracto a ratinhos e recolhendo e analisando o plasma dos mesmos.

De modo semelhante ao estudo de biodisponibilidade plasmática, também pode ser estudado o tipo de compostos que têm capacidade de chegar ao cérebro, após a administração de extracto aquoso de F.

Durante os diversos processos de metabolismo descritos no presente trabalho, o extracto aquoso de F.

vulgare vai sofrendo alterações na sua composição, do mesmo modo, os estudos propostos também

deverão revelar modificações. Deste modo, propõe-se, também, a realização de um estudo mais geral e completo que englobe uma metabolização contínua dos compostos polifenólicos do extracto aquoso de

F. vulgare, desde a sua ingestão oral até à sua biodisponibilidade cerebral. Além de serem registadas as

alterações na composição química do extracto, deverão também ser tidas em conta alterações a nível biológico, avaliando-se, por isso, a capacidade inibitória da acetilcolinesterase e a actividade antioxidante durante as várias fases metabólicas.

Outro aspecto que também pode ser abordado prende-se com a utilização de lipossomas como veículo de transorte dos compostos com actividade biológica presentes no extracto aquoso de F. vulgare, caso estes não tenham a capacidade de, por si sós, atravessar a barreira hemato-encefálica. A incorporação dos compostos polifenólicos em lipossomas também poderá evitar a sua metabolização e, portanto, que uma maior quantidade fique disponível no cérebro para actuar no combate à AD.

Na vertente inflamatória da doença de Alzheimer, podem também ser estudados outros efeitos do extracto aquoso de F. vulgare sobre doenças periodontais. Nesta área podem ser realizados estudos sobre a inibição de α-amilase ou inibição da adesão de bactérias cariogénicas à superfície do dente.

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Anexos

Anexo I: Representação gráfica do ensaio com pirogalol realizado para a determinação do conteúdo

fenólico total dos extractos aquosos F1, F2 e F3.

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 A b s76 0 n m [pirogalol] (mg/mL) Equação y = 1,532x - 0,009 R2 0,9963

Anexo II: Representação gráfica dos ensaios de inibição da acetilcolinesterase (AChE) realizados para a determinação do valor de IC50. 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 10 20 30 40 50 60 70 In ib iç ã o A C h E ( % ) [extracto] (mg/mL) Equação y = 45,437x -27,190 R2 0,9236

Extracto aquoso de Foeniculum vulgare F1.

1 2 3 4 5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 In ib iç ã o A C h E ( % ) [extracto] (mg/mL) Equação y = 18,812x - 5,25 R2 0,99905

Extracto aquoso de Foeniculum vulgare F2.

1 2 3 4 5 0 20 40 60 80 100 In ib iç ã o A C h E ( % ) [extracto] (mg/mL) Equação y = 18,573x - 8,45 R2 0,9772

Anexo III: Representação gráfica dos ensaios de extinção de DPPH (actividade antioxidante) realizados

para a determinação do valor de EC50.

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0 20 40 60 80 100 E x ti n ç ã o D P P H ( % ) [extracto] (mg/mL) Equação y = 1429,035x + 17,160 R2 0,93834

Extracto aquoso de Foeniculum vulgare F1.

0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 E x ti n ç ã o D P P H ( % ) [extracto] (mg/mL) Equação y = 952,792x + 5,336 R2 0,9993

Extracto aquoso de Foeniculum vulgare F2.

0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 E x ti n ç ã o D P P H ( % ) [extracto] (mg/mL) Equação y = 735,906x + 7,69 R2 0,99887

Anexo IV: Evidências bibliográficas para a identificação dos compostos maioritários existentes no

extracto aquoso de F. vulgare.

Espectro UV-Vis da eriocitrina (eridioctiol-7-O-rutinósido) (retirado de Parejo I. et al., 2004a)

Cromatograma de análise por HPLC de extracto aquoso de F. vulgare. 1 – 3-CQA; 2 – 5-CQA; 3 – 4-CQA; 4 – 1,3- diCQA; 6 – rutina; 7 – miquelianina; 8 – 1,5-diCQA; 9 – 1,4-diCQA (retirado de Krizman M. et al., 2007)

Anexo V: Metabolismo pancreático.

Cromatograma da análise por HPLC do controlo do ensaio de metabolismo pancreático.

RT:3.98 - 19.96 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Time (min) -10000 -5000 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 u A U 10.45 4.27 7.76 5.42 5.92 6.64 7.14

Anexo VI: Metabolismo intestinal por células Caco-2. 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100 120 V ia b ili d a d e c e lu la r ( % ) [extracto] (mg/mL)

Representação gráfica do ensaio de viabilidade das células Caco-2 em função da concentração de extracto aquoso de F. vulgare, baseado no reagente MTT.

Cromatograma da análise por HPLC do ensaio controlo do metabolismo por células Caco-2, realizado com HBSS.

Cromatograma da análise por HPLC do conteúdo intracelular das células Caco-2, no final do ensaio de metabolismo de extracto aquoso de F. vulgare 1,0 mg/mL, por células Caco-2.

RT:3.98 - 19.98 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Time (min) -10000 -8000 -6000 -4000 -2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000 u A U 12.35 5.00 5.95 6.66 RT:3.98 - 19.98 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Time (min) -13000 -12000 -11000 -10000 -9000 -8000 -7000 -6000 -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 u A U 12.20 4.83_5.47 5.95 7.23 7.86 8.93

Anexo VII: Cromatograma da análise por HPLC do padrão quercetina 0,005 mg/mL. RT:3.98 - 19.98 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Time (min) 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000 550000 600000 650000 700000 750000 800000 850000 900000 950000 u A U 17.58 5.03 5.95 6.58 7.19

Anexo VIII: Glucuronidação de quercetina por homogenato de fígado de ratinho.

Cromatograma da análise por HPLC do padrão quercetina 40 µM, sujeito a metabolismo hepático, por homogenato de fígado. 300 400 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 In te n s id a d e (  A U ) c.d.o. (nm) 12,57 14,41 14,78 17,71

Sobreposição dos espectros de absorção (entre 300 e 450 nm) das formas conjugadas de quercetina, resultantes do ensaio de metabolização com homogenato de fígado.

RT:3.98 - 19.98 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Time (min) 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 55000 60000 65000 70000 75000 80000 85000 90000 95000 u A U 12.57 12.77 14.78 14.41 6.92 _17.71 5.30 10.70 7.17 7.40 8.20 9.06 9.79 11.91 15.55 16.35 19.70

No documento Estudo de metabolismo, in vitro, de extractos aquosos de funcho, Foeniculum Vulgare: aplicações terapêuticas na doença de Alzheimer (páginas 92-108)