No âmbito do REVIVE tem-se efetuado a pesqui- sa dos agentes patogénicos transmitidos por mosquitos com maior impacto em saúde pública, presentes ou em risco de serem introduzidos em Portugal. Neste sentido, todos os pools de mos- quitos de espécies com capacidade vetorial, têm sido pesquisados para a presença de ácidos nu- cleicos de flavivírus (que incluem os vírus West Nile, Dengue, Febre Amarela, Zika, Encefalite Ja- ponesa e outros).
A pesquisa do plasmódio da malária em mosqui- tos do complexo Anopheles maculipennis cap- turados no âmbito da vigilância em aeroportos, também está preconizada no âmbito do REVIVE. Em 2015 não foram identificados An. maculipennis nos aeroportos.
O género Flavivírus inclui um grupo diverso de vírus que parecem ter evoluído de forma concer- tada com os seus vetores, podendo ser divididos em quatro grupos: I - transmitidos por carraças; II - transmitidos por mosquitos, III - sem vetor conhecido e IV - específicos de insetos (Insect Specific Flavivirus, ISFs ) que podem representar um grupo primordial de flavivírus, aparentemente incapazes de infetar vertebrados19, 20, 21.
Devido aos casos de infeção humana22 e equina23 por vírus West Nile detetados no Algarve em
agosto de 2015, todos os pools de espécies vetoras deste vírus desta região (e alguns sele- cionados de outras regiões do país) foram espe- cificamente pesquisados para a presença de ARN do vírus West Nile por RT-PCR em tempo real24. No total foram analisados por PCR em tempo real para deteção do vírus West Nile, um total de 648 mosquitos em 43 pools de espécies vetoras (dos quais 64% do Algarve). Todos os pools analisados foram negativos.
A totalidade dos espécimes de mosquitos adul- tos Aedes aegypti provenientes da Madeira são testados para a presença de flavivírus, devido ao surto de dengue que ocorreu em 2012/2013 naquela ilha. Uma parte dos mosquitos que chegam no estádio de ovo da Madeira são colo- cados a eclodir e posteriormente analisados na forma de adulto.
Em 2015, no total foram pesquisados para a presença de flavivírus 5065 mosquitos em 217 pools de espécies vetoras. Nesta amostra não foram identificados flavivírus patogénicos para o Homem, nem ISFs.
Os ISFs representam um subgrupo de flavivírus com uma elevada diversidade genética. Até ao momento apenas foram isolados ou detetados em insetos, apresentando incapacidade ou dificulda- de de se replicar em células de vertebrados. O primeiro ISF reconhecido foi o Cell Fusing Agent
19. Calzolari M, Zé-Zé L, Vázquez A, Seco MPS, Amaro F, Dottori M. Insect-specific flaviviruses, a worldwide widespread group of viruses only detected in insects. Infection, Genetics and Evolution. 2015. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.meegid.2015.07.032 20. Calzolari M, Zé-Zé L, Růžek D, Vázquez A, Jeffries C, Defilippo F, Osório HC, Kilian P, Ruíz S, Fooks AR, Maioli G, Amaro F, Tlusty
M, Figuerola J, Medlock JM, Bonilauri P, Alves MJ, Šebesta O, Tenorio A, Vaux AG, Bellini R, Gelbič I, Sánchez-Seco MP, Johnson N, Dottori M. Detection of mosquito-only flaviviruses in Europe. J Gen Virol. 2012;93:1215-1225.
21. Kuno G, Chang GJ, Tsuchiya KR, Karabatsos N, Cropp CB. Phylogeny of the genus Flavivirus. J Virol. 1998;72(1):73-83.
22. Zé-Zé L, Proença P, Osório HC, Gomes S, Luz T, Parreira P, Fevereiro M, Alves MJ. Human case of West Nile neuroinvasive disease in Portugal, summer 2015. EuroSurveill. 2015;20(38):pii=30024. doi: http://dx.doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2015.20.38.30024.
23. World Organisation for Animal Health. West Nile Fever, Portugal (online) [consult. 20-06-2015].
www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/Review?page_refer=MapFullEventReport&reportid=18585
24. Barros S C, Ramos F, Zé-Zé L, Alves M J, Fagulha T, Duarte M, et al. Simultaneous detection of West Nile and Japanese Encephalitis virus RNA by duplex TaqMan RT-PCR. J Virol Methods. 2013;193(2):554-7. doi: 10.1016/j.jviromet.
Virus (CFAV) que foi isolado em 1975 de uma linha celular de Ae. aegypti25. Com a percepção da importância dos arbovírus como zoonoses emer- gentes e o desenvolvimento de programas de vigi- lância entomológica, o isolamento e detecção de ISFs tem sido reportado em todos os continentes. No âmbito do REVIVE foram detetados três tipos diferentes de ISFs, associados a diferentes géne- ros de mosquitos Aedes (Ae. aegypti na Madei- ra, 2010, 2013 e 2014), Culex (Cx. theileri em Lisboa e Vale do Tejo, 2008, e no Alentejo em 2009 e 2010) e Ochlerotatus (Ochlerotatus cas- pius no Algarve, 2008).
Na análise filogenética, apresentada na Figura 14 pode-se observar que todas as sequências de flavivírus identificadas até ao momento no âmbito do REVIVE, pertencem ao grupo dos vírus espe- cíficos de insetos, que são completamente distin- tos dos vírus dos grupos de causam doença no Homem. Os flavivírus patogénicos apresentados na Figura 14, representam sequências de vírus identificados no INSA em casos importados (vírus Dengue e Zika) e autóctones (Dengue 1, Madeira) no âmbito do diagnóstico, ou isolados a partir de mosquitos (West Nile, Roxo).
25. Stollar V, Thomas VL. An agent in the Aedes aegypti cell line (Peleg) which causes fusion of Aedes albopictus cells. Virology. 1975;64(2):367-77. Flavivírus específicos de Insetos REVIVE/INSA Flavivírus Diagnóstico INSA RE VIVE Cx thF V Alentejo09 RE VIVE Cx thF V Alentejo10(2) EU716420 Cx thF V 07 PT RE VIVE Cx thF V Alentejo10 RE VIVE Cx thF V LV T08(2) RE VIVE Cx thF V LV T08 REVIVE AeaeFV Madeira10 REVIVE AeaeFV Madeira13 REVIVE AeaeFV Madeira13(2) REVIVE AeaeFV Madeira14 EU716415 CxunF V 07 PT
EU716415 OccaF V 07 PT Marim vírus OccaF V Algar ve06 RE VIVE OccaF V Algar ve08
KU7572545 Zika 472846 Brasil15 KU752544 Zika 469196 Brasil15
WNV Roxo PT DENV4 274355 Brasil13 DENV4 315997 Brasil14 DENV1 213149 Madeira12 DENV1 334322 Brasil14 DENV1 238595 Indonésia13 DENV1 242889 Angola13 DENV2 423450 China15
Figura 14: Árvore filogenética máxima parcimónia baseada em sequências parciais da proteína não estrutural NS5 obtida recorrendo ao software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA), versão 6. Os valores de bootstrap superiores a 60 são apresentados na árvore. Os flavivírus específicos de insetos estão representados a azuis e os flavivírus patogénicos para o Homem identificados no INSA (no âmbito do diagnóstico laboratorial) estão representados a vermelhos. Todas as sequências apresentam a identificação do vírus, país ou região de origem e ano de deteção: AeeaFV, Flavivírus detetados em Aedes aegypti; CxthFV, Flavivírus detetados em Culex theileri; CxunFV, Flavivírus detetados em Culex univitattus; OccaFV; Flavivírus detetados em Ochlerotatus caspius; WNV, vírus West Nile; DENV1, vírus Dengue serotipo 1; DENV2, vírus Dengue serotipo 2; DENV4, vírus Dengue serotipo 4.
0.2 100 99 99 99 99 68 91 100 74