2. REFERERENCIAL TEÓRICO
4.4 PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-BORRELIA BURGDORFERI IgG E IgM
(ELISA)
4.4.1 Antígeno utilizado
Antígeno de Borrelia burgdorferi – foram utilizados como substratos antigênicos sonicados totais da Borrelia burgdorferi sensu stricto cepa americana G 39/40 na concentração de 4,8 mg/ml, mantidas no Laboratório de Investigação da Interação entre Microorganismo e Artrite, da Disciplina de Reumatologia, Departamento de Reumatologia, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Centro de referência para a Borreliose de Lyme no Brasil.
4.4.2 Execução do ELISA indireto
As análises por ELISA indireto para detecção de anticorpos contra B. burgdorferi foram procedidas segundo protocolo de Grodzicki et al.9e Yoshinari et al.:18
1. Foram sensibilizadas duas placas de 96 orifícios (Immulon I), uma para IgG e outra para IgM com 100µl de antígeno, sonicado total de Borrelia burgdorferi cepa G39/40, na concentração de 15µg/ml, diluído em tampão carbonato pH 9,6. 2. A placa foi incubada em câmara úmida, a 4°C overnight.
3. Em seqüência, a placa foi lavada por cinco vezes com tampão fosfato (PBS) com 0,05% de Tween 20, pH 7,4.
4. Após, foi realizado o bloqueio dos sítios da placa com a adição de 100µl da solução protéica feita com leite desnatado a 5% diluído em PBS com 0,05% de Tween 20, pH 7,4, com incubação da placa em câmara úmida, por 1 hora, à temperatura ambiente.
5. Após 1 hora, as placas foram lavadas por cinco vezes com PBS com 0,05% de Tween 20, pH 7,4.
6. Em seguida, foi preparada a diluição do soro padrão positivo, controles negativos e soros teste, utilizando-se PBS-Tween com 5% de leite desnatado pH 7,4; depois de preparadas, as amostras de soro foram adicionadas aos poços da placa, incluindo um controle positivo, 8 controles negativos e os soros dos doadores em duplicata nas diluições de 1/100 para IgM e 1/400 para IgG e, então incubadas por 1 hora em temperatura ambiente.
7. Após 1 hora, as placas foram lavadas por cinco vezes com PBS Tween 0,05% pH 7,4.
8. Posteriormente, foi adicionado 100 µl de conjugado; soro de cabra, anti- imunoglobulina específica humana (anti-IgM ou anti-IgG) conjugado à enzima fosfatase alcalina (Sigma), diluído a 1/1000 em PBS-Tween com leite desnatado pH 7,4 e, depois incubadas em câmara úmida por mais 1 hora em temperatura ambiente
9. Após o tempo de incubação, as placas foram novamente lavadas por cinco vezes com PBST 0,05% pH 7,4.
10. Posteriormente, foram adicionados 100µl em cada orifício da placa de solução substrato revelador – para-nitro-fenil-fosfato (PNPP), na concentração de 1mg/ml, diluído em tampão glicina pH 10,5 para leitura em espectrofotômetro para ELISA (Labsystems Multiskan MS) em comprimento de onda de 405 nm.
11. Interpretação dos resultados – uma amostra foi considerada positiva se apresentasse uma DO (densidade óptica) igual ou maior ao valor do cut-off, que é obtido pela média dos valores de DOs dos controles negativos mais três vezes o desvio padrão desses valores, garantindo um nível de confiança de 99,8%.
12. Os valores em DOs expressos pelo espectrofotômetro para as microplacas foram convertidos em títulos, utilizando para esse fim um gráfico de calibração do título, em papel milimetrado. O título considerado positivo para IgG foi maior ou igual a 1/400 e para IgM maior ou igual a 1/100.
4.5 PESQUISA DE ANTICORPOS ANTI-BORRELIA BURGDORFERI
IgG E IgM PELO WESTERN BLOTTING
A separação eletroforética e as análises por Western blotting para B. burgdorferi em humanos foram procedidas segundo protocolo de Grodzicki et al.9e Yoshinari et al.42
4.5.1 Execução da eletroforese
Para realização do trabalho, procedeu-se a eletroforese vertical do extrato total de Borrelia burgdorferi cepa G39/40 (obtido através do sonicado total da Borrelia burgdorferi cepa G 39/40, de origem americana), preservado no laboratório através de passagem em meio de cultura BSK, ou conservado congelado em nitrogênio líquido reduzido com dithiothreitol (Bio Rad) em gel de poliacrilamida a 10% com uso de pente contínuo. A eletroforese foi realizada em aparelho Protean II (Bio Rad), com amperagem de 25mA, em câmara fria.
As proteínas do gel foram transferidas para o papel de nitrocelulose com porosidade de 0,2µm através de cuba de transferência Protean II (Bio Rad) durante 18 horas com voltagem de 25 mV, em câmara fria.
Após transferência do antígeno, o papel de nitrocelulose foi corado com Ponceu (por 10 minutos) e lavado com água destilada para retirar o excesso do corante.
4.5.2 Execução do Western blotting
O papel de nitrocelulose, obtido anteriormente na eletroforese, foi cortado em tiras e incubado com tampão Tris (TBS) – Tween 0,1% - leite desnatado 5% pH 7,4, durante 1 hora e meia à temperatura ambiente, sob agitação constante.
Posteriormente, as tiras foram lavadas 3 vezes com TBS - Tween 0,1% pH 7,4, 10 minutos cada vez, sob agitação constante.
As amostras de soro foram diluídas na proporção de 1/100 em TBS-Tween 0,1% - leite desnatado 5% pH 7,4, incluindo 1 controle positivo, 1 controle negativo e os soros dos doadores com resultado positivo pelo método de ELISA indireto.
As amostras foram incubadas com as tiras de nitrocelulose, sob agitação constante, por 1 hora à temperatura ambiente.
Após a incubação, as tiras foram lavadas 3 vezes como descrito anteriormente e, então adicionou-se o conjugado; soro de coelho, anti-IgM ou anti-IgG humano conjugado à enzima fosfatase alcalina (Sigma), diluído 1/3.000 para IgM e 1/6.000 para IgG em TBS - Tween 0,1% - leite desnatado 5%, e incubou-se durante 1 hora e meia à temperatura ambiente, sob agitação constante.
As tiras foram lavadas por mais 3 vezes como descrito anteriormente e adicionou-se o substrato, composto por 10mL de tampão Tris para revelação com 99µL de solução de NBT (nitrobluetetrazolium) e 66µL de solução de BCIP (bromocloroindolilfosfato) em 2 placas de Petri, nas quais as tiras foram distribuídas separadamente (IgG e IgM).
Após a adição de 1ml de substrato por fita de papel de nitrocelulose, as placas foram mantidas sob agitação constante e protegidas da luz, e aguardou-se o aparecimento de bandas no controle positivo, quando a reação foi bloqueada com água destilada.