NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO DỪA CẠN CATHARANTHUS ROSEUS
IV. CÁC PHƯƠNG THỨC NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH 2 Tạo chồi bất định
•
- Thực hiện quá trình phản phân hoá và tái phân hoá tế bào để bắt các tế bào soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo.•
- Ở cây 1 lá mầm: lan, dứa, hoa loa kèn,… 3. Tạo phôi vô tính•
Tương tự như tạo chồi bất định, nhưng phôi vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao gồm cả chồi mầm và rễ mầm.•
Phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất hạt giống nhân tạo.
Sự hình thành phôi vô tính có 2 bước:Bước 1: phân hóa tế bào có khả năng phát sinh phôi ( thường là các tế bào nhỏ, nhân lớn nhiều hạch nhân,không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và mRNA. Cần môi trường giàu auxin.
Bước 2: sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành. Môi trường nghèo hoặc không có auxin ( nồng độ auxin cao kích thích hình thành phôi vô tính nhưng ức chế quá trình phân hóa và phát triển tiếp theo của phôi.
•
Từ việc tạo phôi vô tính người ta đã sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính•
Nguyên liệu:
Các Polyme sinh học
Phôi vô tính
Môi trường dinh dưỡng tạo hạt nhân tạoThường sử dụng polyme tự nhiên Alginate để tạo hạt nhân tạo.
•
Cách thực hiện:•
+ Dùng polyme bao gói 1 phôi vô tính với 1 thể tích nhất định chất dinh dưỡng để tạo hạt.•
Quy trình cụ thể như sau:•
Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi trường dinh dưỡng với mật độ phù hợp và bổ sung Na – alginate dược làm tan trong nước với nồng độ 2-4%.•
Dùng pipet nhỏ 100 – 150 µl huy ền phù nêu trên có ch ứa 1 phôi soma và dung d ịch Cacl2 (2-5%). Khi đó s ẽ sinh ra ph ản ứng trao đ ổi ion Na – Ca và h ạt nhân t ạo đư ợc hình thành, có đ ủ đ ộ c ứng thích h ợp. ngâm trong nư ớc làm c ứng h ạt.•
Dùng Ca – alginate thường hạt luôn luôn ẩm ướt bề mặt, hiện nay người ta dùng 1 loại polymer Elvax (4260) để bao lớp alginate.•
Giai đoạn kế tiếp là làm khô hạt để giúp hạt nhân tạo dễ dàng bảo quản và nảy mầm khi cần thiết. Kitto và Janick, đặt hạt cây cà rốt trên khay có chứa 25%polyoxyethylene để làm mất nước và khi làm ướt lại thì hạt được tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Chú ý
•
Hệ thống sản xuất hạt nhân tạo phải được cơ giới hóa và không phụ thuộc vào những thiết bị đắt tiền và nhất là thỏa mãn yêu cầu vô trùng.•
4. Ngoài ra còn có phương pháp nhân giống qua tạo củ in vitro. Những công nghệ nới trong vi nhân giống cây trồng1. Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng.
Nghiên cứu tập trung vào vấn đề nuôi cấy mô trên môi trường không có đường nhưng được điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2
VD: Phòng công nghệ tế bào viện sinh học nhiệt đới đã tiến hành nuôi cấy mô quang tự dưỡng thành công theo 2 phương pháp:
1. Trao đổi khí tự nhiên (khí trao đổi bằng cách khuếch tán qua màng millipore hoặc nút giấy)
2. Bơm khí trực tiếp (khí được bơm trực tiếp vào hộp nuôi cấy)
•
Ưu điểm:- Tốc độ sinh trưởng, chất lượnh và tỉ lệ sống của mô thực vật được nâng cao ở tất cả các bước trong điều kiên tự dưỡng.
- Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế. - Tỉ lệ đột biến có thể được giảm.
- Tự động hóa =>giảm chi phí lao động.
•
Nhược điểm:- Chi phí cao cho việc điều khiển môi trường.
- Chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể. 2. Bioreactor
•
Bioreactor là một hệ lên men hay nồi phản ứng sinh học.•
Là thiết bị mà trong đó sự biến đổi hóa sinh được tiến hành bởi các tế bào sống hoặc các thành phần tế bào invivo. Thường dùng để lên men lien tục, bán lien tục hay gján đoạn.•
Có thể dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối.•
Cũng có thể dùng trong nuôi cấy mô để nhân nhanh các giống cây•
- Takayama và Miasawa là những người đầu tiên sử dụng bioreactor vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp.•
- Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa.•
VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone có khả năng sản xuất 100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1lit dịch huyền phù nếu như dung dịch đó được đặt trên 1tấm giấy lọc và phát triển trong 4tuần.Bioreactor sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật được cải tiến từ các loại bioreactor trong nuôi cấy tế bào vi sinh
•
Thuận lợi;- Thể tích nuôi cấy tăng => sản xuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần những kĩ thuật cao cấp.
- Hầu hết các bình bioreactor được thiết kế với cơ chế khuấy bằng cơ học hay thổi khí để duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng.
- Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật lí có thể được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng. Điều này không thể thực hiện với hệ thống nuôi cấy bình tam giác.
•
Nhược điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo Pg166 bioreactor
•
CÂY GỖ NGHIẾN•
CÂY XOAN•
NUÔI CẤY VÔ TÍNH CÂY DỨA (THƠM) V. Ứng dụng1. Trong nông nghiệp
•
Sản xuất nhanh chóng các giống cây trồng đáp ứng được nhu cầu về cây giống cao trong trồng trọt.•
Giống là một khâu rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Công tác giống chủ yếu bao gồm các khâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo, tuyển chọn, thử nghiệm giống và nhân giống.
•
Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày nay phần lớn các công việc này được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh chóng•
VD: chu ối, khoai tây…•
Nhân gi ống ổn đ ịnh ch ất lư ợng, năng su ất cao ph ẩm ch ất t ốt•
VD: Các cây tr ồng chuy ển gen, con lai F1…•
T ạo gi ống s ạch b ệnh ch ống ch ịu v ới môi trư ờng•
VD: khoai tây s ạch virus, hoa lily s ạch b ệnh…•
2. Trong công nghiệp•
Dây chuyền sản xuất nhân nhanh các giống hoa cây cảnh phục vụ cho thị trường.•
VD: Nhờ nuôi cấy mô vào sản xuất các giống hoa như: tuylip, đồng tiền, hoa ly ở Hà Lan. Sản xuất hoa lan ở Trung Quốc, đồng tiền ở Việt Nam, Cẩm Chướng …• Cây hoa cẩm chướng đang ra hoa trong ống nghiệm - in vitro flowering of Dianthus caryophyllus L
•
Dây chuyền sản xuất giống cây con cung cấp cho thị trường, giảm giá thành sản phẩm.•
VD: sản xuất cây giống lâm nghiệp theo quy mô công nghiệp: Bạch đàn, keo…•
3. Trong y học•
Ứng dụng sản xuất nhanh sinh khối các cây dược liệu bằng thu sinh khối callus hoặc thể huyền phù.•
VD: nhân nhanh sâm Triều Tiên… nhân sâm Ngọc Linh4. Trong nghiên cứu khoa học
•
Phục tráng các giống cây quý hiếm nằm trong sách đỏ VD: Cây sưa - Dallbergia tonkinensis:cây lan hài đỏ quí nhất Việt Nam
•
Nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ góp phần giải quyết một cách có hiệu quả công tác giống cây trồng mà còn mở ra một chân trời mới trong nghiên cứu di truyền thực vật, các cơ chế sinh tổng hợp ở thực vật, sinh lý phát triển, vai trò của phytohormone trong đời sống thực vật và nhiều vấn đề sinh học cơ bản khác•
Khắc phục các hiện tượng bất thụ trong lai xa•
Bảo quản nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm•
Tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài ở nhiệt độ thấp mà không mất tính toàn thể của tế bào.•
Làm cơ sở cho các kỹ thuật di truyền khác là khâu cuối cùng cho các công tác đánh giá giống.
Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô: + Hạn chế của vi nhân giống+ Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay, không phải tất cả cây trồng đều được nhân giống thương phẩm bằng vi nhân giống.
+Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen.
+ Nhiều vấn đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa được giải đáp.
•
Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo. Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.•
Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ.•
Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất về mặt di truyền.•
Ngoài ra còn xảy ra hiện tượng nhiễm mẫu. VI. Quy trình cụ thể•
Quy trình nhân giống hoa Lan bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro•
Lan là loại hoa vương giả, với vẻ đẹp vương giả, quý phái nên khắp nơi trên thế giới ngày càng có nhiều người thích chơi hoa Lan. Chính vì vậy, hoa Lan là sản phẩm trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao.•
Bắt kịp thị hiếu này, ngày nay đã xuất hiện nhiều cơ sở kinh doanh hoa Lan với nhiều chủng loại, giá cả khác nhau. Do đó, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô in- vitro tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền và đáp ứng giá cả phải chăng là vô cùng hữu ích.•
Sau đây, chúng tôi xin giới thiệu quy trình cơ bản nhân giống Lan bằng phương pháp nuôi cấy mô in-vitro:•
Quy trình trên được tiến hành qua các giai đoạn sau:•
1. Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy:•
Tách các vảy hành ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng.•
Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70% trong 30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25 phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy. Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4 - 5 lần•
Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non.•
Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 700 trong 1 giây và rửa với nước cất vô trùng.•
Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng. Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trường nhân giống ban đầu.•
Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 220C - 260C và tuỳ vào mỗi loài.•
Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi.•
Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước của chồi.•
Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi). Mỗi đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và cấy chuyền sang môi trường mới.2. Nhân giống:
•
Môi trường nhân giống thường là môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) có bổ sung các chất điều hoà tăng trưởng (auxin, cytokinin,…) với tỷ lệ phù hợp tùy loài nhằm tạo điều kiện cho quá trình nhân chồi.•
Nồng độ các chất điều hoà sinh trưởng nên giảm dần trong các lần cấy chuyển sau đó. Các chất chiết trái cây cũng được đề nghị dùng như nước cốt cà chua, nước dừa, nước chuối, nước khoai tây... Nhưng chúng chỉ có hiệu quả trong các lần cấy chuyển và thể tích cũng không quá 10% thể tích môi trường.•
3. Tái sinh cây hoàn chỉnh in-vitro:•
Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ).•
Sau 4 -5 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con.•
4. Chuyển cây ra vườn ươm:•
Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá có thể chuyển sang cấy vào bầu đất mùn vô trùng có bổ sung các chất dinh dưỡng.Sau một thời gian cây phát triển ổn định ta đem chuyển vào chậu. Sau khi chuyển chậu khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật.
•
Như vậy, từ một mô hoa Lan được chọn nuôi cấy cho đến ra cây con có 3-4 lá chuyển ra vườn trồng mất thời gian khoảng từ 8 đến 11 tháng.•
Với phương pháp nhân giống vô tính như trên sẽ đảm bảo tạo ra cây con mang đặc tính giống hoàn toàn với cây cha mẹ (cây con ổn định về mặt di truyền), cây con không nhiễm bệnh và tạo được một số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn.•
Tuy nhiên, việc cấy mô phải được thực hiện thật nghiêm túc và tỉ mỉ theo đúng quy trình, phải có điều kiện về trang thiết bị đầy đủ, môi trường nhân tạo thích hợp, đặc biệt là điều kiện vô trùng phải được đảm bảo nghiêm ngặt.•
Cần chú ý thêm, đối với các loài không phải là cây bản địa, phải được thuần hoá tại vùng mới chọn mẫu đem nuôi cấy, có như vậy mới đảm bảo hiệu quả từ khâu nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đến trồng ngoài vườn ươm.•
Cuối tháng 10 vừa qua, Viện Di truyền nông nghiệp cũng đã công bố nhân giống công nghiệp và bán công nghiệp thành công đối với một số loài hoa và cây lâm nghiệp có giá trị kinh tế cao; tuyển chọn được 18 giống hoa lyly, 10 giống hồng môn với những sắc màu, kiểu dáng đa dạng có giá trị kinh tế cao và trên 15 vạn cây giống sa nhân, tếch, trầm hương...• Nuôi cấy mô tạo giống cây mới tại Viện Công nghệ sinh học.
•
Ông Đỗ Năng Vịnh - Phó Viện trưởng Viện Di truyền nông nghiệp - cho biết:"Tạo phôi vô tính, hạt nhân tạo là công nghệ tiên tiến trên thế giới, lần đầu được nghiên cứu ở nước ta. Phát hiện này đã được nhiều công ty giống tiếp nhận để phổ biến trong hệ thống sản xuất nông nghiệp công nghệ cao".