PHD3

As Prolil-4-hidroxilases (PHDs) são proteínas pertencentes à familia das dioxigenases e são dependentes de Ferro II (Fe2+), Oxigênio 2 (O2) e 2- oxoglutarato (2-OG) como substratos para sua atividade catalítica efetiva (BRUICK e MCKNIGHT, 2001). Esta proteína tem sido conhecida como sensor de oxigênio pois sua afinidade com este elemento é em torno de 2 a 10 vezes superior às concentrações fisiológicas (HIRSILA et al., 2003).

A taxa de oxigênio intracelular permite que a atividade da PHD seja modulada ao longo de toda gama fisiológica (KAELIN e RATCLIFFE, 2008), normalmente, as PHDs realizam a hidroxilação de resíduos prolil nas subunidades alpha do fator induzível por hipóxia (HIF1-α) para serem degradadas posteriormente. No entanto, em condições hipóxia, a atividade enzimática das PHDs é inibida, levando ao acúmulo de HIF-1 (SCHOFIELD e RATCLIFFE, 2004; FONG e TAKEDA, 2008; KAELIN e RATCLIFFE, 2008).

A sensibilidade das PHDs para Ferro II (Fe2+), Oxigênio 2 (O2), 2-oxoglutarato (2- OG) e estado redox da célula é mais notável num microambiente de grave distúrbio metabólico e estresse oxidativo, muitas vezes observado em um microambiente tumoral, como é no câncer colorretal (CHANDEL et al., 2000; DEHNE e BRUNE, 2009; PLACE e DOMANN, 2013). Outro fator ambiental capaz de alterar a atividade das proteínas PHDs é a concentração de diferentes tipos de metais no ambiente pois o organismo não apresenta um mecanismo de expulsão desses na célula, tendo, portanto, acesso irrestrito aos sítios de ligação de ferro das dioxigenases, causando inibição funcional dessa família de enzimas (CHEN e COSTA, 2009; SALNIKOW e ZHITKOVICH, 2008).

A PHD é conhecida como um supressor tumoral devido à sua função de regulação da via de HIF, e sua ausência é relacionada à tumorigênese de câncer colorretal (XUE et al., 2010). A contribuição desta proteína para o fenótipo celular depende de várias condições, incluindo sua abundância relativa em um tecido específico (JOKILEHTO e JAAKKOLA, 2010), de modo que as alterações na expressão das proteínas PHD3, também podem resultar numa alteração da taxa de hidroxilação da HIF1-α (APPELHOFF et al., 2004; SOILLEUX et al., 2005).

Uma vez que a Prolil-4-hidroxilase apresenta tão amplo e profundo efeito sobre tumorigênese, estudos sobre a expressão destas enzimas podem auxiliar na nossa compreensão da progressão do câncer colorretal. Além disso, uma vez que a proteína PHD3 é peça chave para o controle da via de hipóxia, ao estudarmos esta via é necessário avaliar sua expressão antes de buscarmos entender os fatores ambientais envolvidos na regulação da expressão das proteínas que compõem a via de hipóxia

2.3.2. HIF-1α

HIF-1α, também conhecida como aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), pertence à família de proteínas basic helix-loop-helix-Per-ARNT-Sim (bHLH- PAS) e sua expressão é constantemente suprimida na presença de O2 (KAELIN e RATCLIFFE, 2008). Sua transcrição e síntese proteica são constitutivas e particularmente não são afetadas pelo teor de oxigênio (WANG e SEMENZA, 1993), porém a presença do oxigênio atua na regulação da HIF-1α por modificações pós- traducionais, como hidroxilação e ubiquitinação para que ela seja degradada pelo sistema proteossomal (BRAHIMI-HORN, MAZURE e POUYSSEGUR, 2005).

A proteína HIF-1α possui domínios como o PAS (Per-ARNT-Sim), que interage com o domínio PAS da HIF-1β para dimerização (CHOWDHURY, HARDY e SCHOFIELD, 2008). Existem também outros dois domínimos localizados na porção N-terminal (N-TAD) e na C-terminal (C-TAD), os quais atuam na ativação da transcrição gênica, como por exemplo, interagindo com o co-ativador transcricional CBP/p30056 (LANDO et al., 2002). Tanto na porção N-terminal como na C-terminal existe o importante domínio ODD (Oxygen-dependent degradation) que atua na mediação da estabilidade da HIF-1α de acordo com a disponibilidade de oxigênio, uma vez que neste domínio estão localizados sítios para a hidroxilação dependente de oxigênio (Figura 1) (PUGH et al., 1997; RUAS, POELLINGER e PEREIRA, 2002). Sob condições de normóxia, a proteína PHD utiliza o oxigênio como cofator enzimático e transfere um grupo hidroxila para o domínio ODD da HIF-1α (KAELIN e RATCLIFFE, 2008). Após a hidroxilação, esta é reconhecida pela proteína supressora de tumor pVHL (von Hippel-Lindau), que recruta um complexo ubiquitina ligase para marcar a proteína HIF-1α e promover sua degradação proteossomal (Figura 2) (BAEK et al., 2005).

Em condições de hipóxia, a atividade da proteína PHD decresce e a degradação da HIF-1α é reduzida. Uma vez estabilizada, esta é translocada para o núcleo e se dimeriza com a subunidade HIF-1β, formando o complexo HIF-1 transcricionalmente ativo, o qual irá reconhecer uma região no genoma chamada HRE (hypoxia

response elements) ativando a transcrição de seus diversos genes alvo (Figura 3)

Figura 1 - Os domínios bHLH e PAS da HIF-1α mediam a dimerização com a proteína HIF-1β e a ligação do complexo ao DNA. Os domínios N-TAD e C-TAD são requeridos para hidroxilação da proteína HIF-1α e também para a ativação da transcrição gênica. As interações proteína-proteína são indicadas por setas para os dois sentidos. Modificado de Sitkovsky e Lukashev (2005).

Figura 2 - Na presença do oxigênio a proteína PHD hidroxila o domínio ODD da HIF-1α, em seguida

é reconhecida pela pVHL para posterior degradação proteossomal.

Além do seu papel na homeostase do oxigênio há evidências de um importante função da HIF-1α em reações imunológicas. Várias citocinas e outros mediadores inflamatórios têm sido descritos como envolvidos na promoção da expressão da proteína HIF-1α, bem como a ligação do complexo HIF-1 ao DNA sob condições de hipóxia, ou até mesmo normóxia (SCHARTE et al., 2003).

Figura 3 - Esquema de formação do Complexo HIF-1 em condições de hipóxia, em que a proteína PHD em conjunto com a proteína pVHL não são responsáveis pela degradação da HIF-1α, a qual se transloca para o núcleo e se dimeriza à HIF-1β para compor o complexo HIF-1 e transcrever os genes da região HRE.

Em microambientes inflamatórios, a ativação das células imunológicas promove a produção de uma variedade de citocinas como TNF-α e IL-1, alem de espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO) que também aumentam a expressão da HIF-1α. De forma que na inflamação inicial, os macrófagos e neutrófilos produzem uma explosão de ROS, que é crítica para a ação antitumoral dos fagócitos, uma vez que a produção de ROS resulta num aumento de HIF-1α, a qual irá participar na ativação de diversas vias responsáveis por aprimorar o metabolismo dessas células na resposta antitumoral (Figura 4) (DEHNE e BRUNE, 2009).

Uma consequência do aumento de ROS é a oxidação do Fe(II) no sítio catalítico das PHDs, ocasionando bloqueio de sua atividade, sendo assim, a PHD não irá hidroxilar a HIF-1α para que ela seja degradada (GERALD et al., 2004). Outra possibilidade é que ROS iniba as prolil hidroxilases pela oxidação irreversível do sítio ativo de aminoácidos, com resíduos de histidina, resultado na inativação da enzima por oxidação induzida. Portanto essas considerações implicam que, um aumento de ROS durante a inflamação pode contribuir para um acúmulo de HIF-1α

e a ativação do complexo HIF-1 (DEHNE e BRUNE, 2009; KAELIN e RATCLIFFE, 2008).

Figura 4 - Regulação (in)dependente de O2 de HIF-1α no microambiente inflamatório. Múltiplos sinais

afetam transcrição, tradução ou modificações pós-traducionais de HIF-1α. Estes múltiplos sinais, exemplificado por macrófagos, afetam a quantidade de proteína HIF-1α, a atividade de HIF-1 e concomitantemente genes alvo de expressão. Vias que bloqueiam a atividade da PHD são marcadas em vermelho. Vias de sinalização que conduzem à formação do heterodímero HIF-1α/ HIF-1β ativo são mostrados em azul. Fonte: DEHNE e BRUNE, 2009.

Adicionalmente, o NO atenua a ubiquitinação da HIF-1α e atua na redução da atividade da PHD pela alteração do Fe(II) do sítio catalítico destas. Como resultado, ocorre a estabilização da HIF-1α (BRUNE e ZHOU, 2007). Também foi proposto que o aumento da expressão da PI3K aumenta os níveis de HIF-1α em resposta ao NO (BRUNE e ZHOU, 2007). Além disso, espécies ROS e NO, ativam vias a partir de TNF-α e IL-1β, que induzirão a produção de PI3K e/ou NF-κB que por sua vez, irão ativar o complexo HIF-1 (BRUNE e ZHOU, 2007; HELLWIG-BÜRGEL, et al., 1999). Além da regulação dependente de oxigênio, a glicose, presente em altas taxas no intestino, também afeta a expressão da HIF1-α neste órgão, influenciando a

estabilidade e ativação desta, a qual pode ser observada em altas taxas de expressão no intestino saudável em virtude desta regulação por glicose (MALHOTRA et al., 2002; VORDERMARK et al., 2005; STAAB et al., 2007), e em resposta, a HIF1-α regula a expressão de enzimas envolvidas no processo de captação de glicose e glicólise (CHEN et al., 2001; VORDERMARK et al., 2005; STAAB et al., 2007).

Os efeitos da proteína HIF-1α em células tumorais já foram descritos e relacionados com o prognóstico (DONG et al., 2013; KAYA et al., 2012; SANTOS et al., 2012), entretanto não há muitos dados na literatura acerca da expressão da HIF-1α em linfócitos, tampouco sua expressão em infiltrado inflamatório tumoral (MENDES et

al., 2014; THIEL et al., 2007). Essa questão pode ser importante devido à relação

entre a HIF-1α, microambiente tumoral e inflamatório (SITKOVSKY e LUKASHEV, 2005; THIEL et al., 2007) e também a sua relação com a sobrevida de pacientes (MENDES et al., 2014).

2.3.3. VEGF

O complexo HIF-1 também é responsável pela transcrição de fatores de crescimento que podem promover um aumento da taxa de proliferação e redução da morte celular (SEMENZA, 2012b). Um importante fator de crescimento ressurgente desta via é o VEGF (Vascular Endotelial Growth Factor – Fator de Crescimento Endotelial Vascular), que regula a angiogênese tanto fisiológica quanto patológica, e é considerada a molécula mais importante na formação de novos vasos sanguíneos, pois inicia e modula todas as etapas deste processo (CARMELIET e JAIN, 2011). Este fator pertence a uma família multigênica composta por outros quatro membros: VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, P1GF (fator de crescimento placentário). O VEGF é essencial para o crescimento, migração e sobrevivência de células endoteliais, assim como para a morfogênese de vasos sanguíneos (KOWANETZ e FERRARA, 2006).

A formação de novos vasos sanguíneos é reconhecida como elemento chave em diversos eventos fisiológicos e patológicos que envolvem neovascularização, como a embriogênese, crescimento tumoral e cicatrização de feridas (HANAHAN e

WEINBERG, 2011; HORMBREY et al., 2002). De modo geral, a angiogênese é uma resposta do organismo à falta de oxigênio, pois sem o devido suprimento de nutrientes e oxigênio, as células tumorais têm sua capacidade de colonização reduzida e pode entrar em apoptose, no entanto, quando este mecanismo é ativado em tumores sólidos, favorece o crescimento tumoral e aumenta as chances de ocorrência de metástase (ELLIS et al., 2000; DURANYILDIZ et al., 2009).

Além das células tumorais, células do infiltrado inflamatório também podem promover a angiogênese pela expressão de VEGF e estimular o crescimento tumoral (DE NARDO e COUSSENS, 2007; GRIVENNIKOV et al., 2010; LIN et al., 2006; POLLARD, 2008). O VEGF é mediador de diversas etapas da vasculogênese tumoral, incluindo proliferação celular endotelial, permeabilidade vascular e vasodilatação, além de ser responsável pela migração, invasão, sobrevivência e recrutamento de células inflamatórias (ADAMS et al., 2000; ELLIS e HICKLIN, 2008; POLLARD, 2008). Sendo assim, o VEGF se tornou um alvo para terapias anti- tumorais uma vez que a inibição do VEGF leva à regressão tumoral (LEE et al., 2007).

2.3.4. SOD-1

Células têm desenvolvido um sistema para contrapor os radicais livres intracelulares, e dentre as proteínas que compõem a rede antioxidante, as superóxido dismutases (SODs) são enzimas que catalizam a degradação de superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio, subsequentemente convertido em água e oxigênio pela glutationa peroxidase (GSH-Px) e/ou catalase (CAT) (LIOCHEV e FRIDOVICH, 2010; FRANCO et al., 2013; McCORD e FRIDOVICH, 1969; EVANS et al., 2000). A família das superoxido dismutases apresenta três tipos de izoenzimas, e a Cu/Zn- superóxido dismutase (SOD-1) contribui com aproximadamente 70-80% para a atividade das SODs na célula. Esta proteína é amplamente distribuída no citosol, núcleo, peroxissomo e espaço intermembrana das mitocôndrias em células de mamíferos, e é formada por duas subunidades idênticas pesando em torno de 32 kDa cada, contendo um sítio ativo constituído por um átomo de cobre e um de zinco,

ligados entre si por uma ponte de histidina (BANCI et al., 2002; LIOCHEV e FRIDOVICH, 2010).

Inúmeros fatores de transcrição regulam a expressão de SOD, principalmente aqueles sensíveis ao estresse oxidativo, como a proteína AP-1 e o NF-κB, que estão entre os componentes importantes da resposta celular em situação de estresse oxidativo, além de participarem decisivamente nas questões de sobrevivência ou morte celular (KARIN, 1999; SHAULIAN e KARIN, 2002; BUBICI et al., 2006).

Estudos mostram que células tumorais parecem ter um nível baixo de ROS devido à maior expressão de moléculas de eliminação de radicais livres como SOD-1 (CASARIL et al., 1994, VAN DRIEL et al., 1997; JUNG et al., 1997; WANG et al., 2005). O aumento de SOD-1 no meio intracelular pode promover mecanismos de resistência à radioterapia visto que SOD-1 está envolvida na detoxificação celular por transformar os radicais livres (tóxicos) em peróxidos (não tóxicos), em contraste, um suprimento insuficiente de enzimas antioxidantes no meio intracelular, especialmente SOD-1 pode causar uma superprodução de ROS, levando à necrose e apoptose (JIN et al., 2001).

Desta forma, num estudo que visa avaliar inflamação, exposição à fumaça do cigarro e radioterapia, é essencial que seja verificada a presença de proteínas antioxidantes, como a SOD-1, pois, sua elevada expressão está relacionada a uma baixa taxa de radicais livres, o que pode levar a uma pior resposta à radioterapia (MOELLER e DWEHRIST, 2006; ROOTS e SMITH, 1974). Além disso, foi visto que os radicais livres podem diminuir a atividade da proteína PHD3 (CHANDEL et al., 2000; DEHNE e BRUNE, 2009), então uma elevada expressão de SOD-1 poderia atenuar a presença dos radicais livres intracelulares, culminando com uma boa atividade da PHD3 em regular a expressão do complexo HIF-1, resultando em uma baixa oxigenação local e consequentemente uma pior resposta à radioterapia.

2.3.5. Receptor de Adenosina 2A

Além do Complexo HIF-1 ativar a progressão tumoral através da transcrição de genes de fatores de crescimento, ele também pode permitir o crescimento tumoral

pela ativação de uma via imunossupressora regulada pelo Receptor de Adenosina 2A (RA2A).

Como visto, em caso de resposta exacerbada do sistema imunológico, ocorre a ativação de vias imunossupressoras a fim de evitar que ocorram mais danos ao tecido saudável. E o dano colateral menos tolerado durante uma resposta imune é o dano às estruturas da microcirculação, o que se reflete imediatamente na interrupção do suprimento sanguíneo local. A diminuição local no suprimento de oxigênio e a hipóxia tecidual local resultantes são os principais eventos que indicam a necessidade de se interromper o dano colateral por células imunes hiperativas (SITKOVSKY e OHTA, 2005).

Esta condição de dano à microcirculação gera uma hipóxia local (além da hipóxia comumente observada em microambientes inflamatórios) que altera o metabolismo celular e causa um forte acúmulo extracelular de adenosina. Até curtos períodos de hipóxia pode permitir o acúmulo de adenosina em virtude do elevado gasto e baixa produção de ATP levando ao acúmulo de AMP (SITKOVSKY et al., 2004).

Enzimas com regulação mediada por hipóxia estão envolvidas no acúmulo de adenosina como Adenosino Kinase (AK) e 5’-nucleotidase (NT5), transcrita pelo complexo HIF-1. A Adenosino Kinase, a qual tem a função de refosforilar a adenosina e convertê-la em AMP, é inibida em hipóxia, enquanto que a 5´- nucleotidase tem a função de clivar o AMP em Adenosina e fosfato (DECKING et al., 1997; KOBAYASHI, ZIMMERMANN e MILLHORN, 2000; SYNNESTVEDT et al., 2002)

A adenosina tem um importante papel imunossupressor, pois ativa vias de sinalização para a expressão de Receptores de Adenosina que podem agir como reguladores de células imunológicas (HUANG et al., 1996; SITKOVSKY et al., 2004). A concentração de adenosina extracelular irá determinar a intensidade de sinalização e expressão dos Receptores de Adenosina (SITKOVSKY e OHTA, 2005).

Existem quatro Receptores de Adenosina que podem ser distribuídos na superfície da célula: RA1, RA2A, RA2B e RA3 (FREDHOLM et al., 2001; LINDEN, 2001). Os

RA2A e RA2B são acoplados a proteínas G estimuladoras (Gs) de sinalização

através dos quais resulta em aumento das concentrações de cAMP (HUANG et al., 1997; KOSHIBA et al., 1997; LUKASHEV et al., 2003).

Linfócitos T expressam, principalmente, os receptores RA2A e RA2B, entretanto os

RA2A têm uma alta afinidade pela enzima Adenilil Ciclase, portanto são os maiores

responsáveis pela imunossupressão em linfócitos (SITKOVSKY et al., 2004). De importância, o aumento de cAMP provocado pela ativação dos receptores RA2A

resulta em bloqueio do TCR (T Cell Receptor – Receptor de Células T) e consequentemente inibição do reconhecimento de antígeno tumoral, ativação celular e expansão clonal (SITKOVSKY e OHTA, 2005), além de inibir a produção e exocitose de citocinas pró-inflamatórias, citocinas citotóxicas, grânulos e FasL (HUANG et al., 1997; KOSHIBA et al., 1997; MARONE, PLAUT e LICHENSTEIN, 1978). Este aumento de cAMP mediado por RA2A também é responsável pela

upregulation de citocinas anti-inflamatórias e indução de apoptose, pois todos os

linfócitos T ativados para o antígeno tumoral que forem suprimidos serão induzidos à anergia, seguida de apoptose (SITKOVSKY, 2003; SITKOVSKY et al., 2004).

O número de receptores RA2A por célula eventualmente irá determinar a intensidade

da imunossupressão causada pela adenosina. De fato, a quantidade de cAMP induzida pela adenosina em células T é dependente do número de receptores RA2A

(ARMSTRONG, et al., 2001). As respostas causadas por cAMP tem um efeito a longo prazo, então uma vez que esta molécula ativa os mecanismos anti- inflamatórios, estes são irreversíveis (SITKOVSKY, 2003).

2.3.6. Foxp3

Outra forma de imunossupressão não mediada pela via de hipóxia ocorre pela ativação de células Treg. Estas células são consideradas como os mais importantes agentes supressores num organismo e apresentam como principal função a de prevenir respostas imunes descontroladas, que muitas vezes podem ser autodestrutivas (FEUERER et al., 2009; YAN e LIU, 2009).

Células Treg são caracterizadas pela expressão do marcador Foxp3 (do inglês

Forkhead Box p3), um fator de transcrição considerado o marcador mais específico

para células Treg, cuja principal função é reprimir vários sinais de ativação de células imune (HORI, NOMURA e SAKAGUCHI, 2003; SCHEREIBER, 2007; SOLOMON e MAGRO, 2008; WADA, 2009).

Assim, as células Treg exercem uma função supressiva em células T, B e dendríticas através do contato direto ou por secreção de citocinas como IL-2 e IL-5, e causam anergia destas células (AZAB et al., 2008; HORI, NOMURA e SAKAGUCHI, 2003). Desta forma a Treg apresenta um papel importante na resolução e término da resposta imune (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2007).

Neste sentido, o equilíbrio entre as funções regulatórias e efetoras das células imunológicas é de extrema importância para a manutenção de respostas imunes eficientes no combate ao tumor e também para a prevenção da lesão tecidual (SUGYUAMA et al., 2005). Ou seja, a atividade funcional das células T efetoras e das células Treg deve estar em condições equilibradas para possibilitar respostas imunes adequadas.

Portanto, como desejamos observar o perfil de imunossupressão no microambiente tumoral, além da avaliação da expressão de RA2A que é um imunossupressor

provindo da via de hipóxia, será necessário avaliar o principal marcador imunossupressor Foxp3.