STI1 e PIAS

Entre os ligantes de STI1 identificados no ensaio de duplo híbrido estão as proteínas PIAS. Esta família de proteínas identificadas inicialmente como inibidores de fatores STAT, também atua como E3 ligase na via de SUMOilação (Palvimo, 2007). Trata-se de uma família constituída por quatro membros - PIAS1, PIASx, PIAS3 e PIASy – envolvidos na SUMOilação de vários fatores de transcrição. Sabe-se que as E3 ligases, apesar de não serem necessárias para SUMOilação de várias proteínas, podem aumentar consideravelmente a eficiência desse processo. Nós novamente avaliamos a co-localização entre STI1 e as E3 ligases identificadas no duplo híbrido: PIAS1, PIASy e Pc2, e a distribuição intracelular de STI1 na presença destas proteínas.

Células PrP3F4 foram co-transfectadas com STI1-YFP e PIAS1 (Figura 8) ou PIASy (Figura 9) na ausência e presença de SUMO. As células foram imunomarcadas com anticorpo anti-myc e analisadas no microscópio confocal. A co- expressão de PIAS1 com SUMO1 ou SUMO3 altera o padrão de distribuição destas proteínas (Figura 8B e C). Tanto PIAS1 quanto SUMO deixam de apresentar expressão difusa e passam a se colocalizar em pequenos grânulos espalhados por todo o núcleo. Essas alterações já foram descritas na literatura e correspondem ao direcionamento de SUMO por PIAS para sítios ativos de SUMOilação (Yamamoto et al., 2003; Ihara et al., 2005; Galanty et al., 2009; Morris et al., 2009).

PIAS1 não formou grânulos na presença de STI1, mas aumentou a localização de STI1 no núcleo por si só e na presença de SUMO1 ou de SUMO3 (Figura 8E, F e G). Observou-se a co-localização entre STI1 e PIAS1 no núcleo. Estes resultados sugerem que PIAS1 esteja envolvida na SUMOilação de STI1, atuando como uma E3 ligase nesse processo. É interessante notar que o translocação de STI1 para o núcleo na presença de PIAS1 e SUMO3 foi maior do que aquele visto somente na presença de SUMO3 (gráficos das figuras 6 e 8). Da mesma forma, o translocação de STI1 para o núcleo mediado por SUMO1 só acontece quando PIAS1 é super expressa. Estas observações mais uma vez implicam PIAS1 como E3 ligase para SUMOilação de STI1, responsável pelo aumento da eficiência deste processo.

CAPÍTULO I: RESULTADOS

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Apesar de haver redundância quanto a SUMOilação de substratos pelas diferentes E3 ligases, existe uma certa especificidade entre as proteínas PIAS (Palvimo, 2007; Galanty et al., 2009). Nós decidimos então testar se PIASy também se co-localiza com ou altera a distribuição intracelular de STI1. Assim como nos experimentos com PIAS1, na presença de PIASy as proteínas SUMO formaram vários grânulos espalhados por todo núcleo. Porém, ao contrário de PIAS1, a PIASy não foi recrutada para os grânulos positivos para SUMO1. Talvez essa diferença se deva ao fato de PIASy ser mais restritiva quanto a sua atividade de E3 ligase, exercendo vários efeitos independentes de SUMOilação (Zhou et al., 2008).

CAPÍTULO I: RESULTADOS 46 STI1 STI1 +PIAS 1 0.0 0.5 1.0 1.5

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Figura 8: Alteração na distribuição intracelular de STI1 induzida por PIAS1.

Células PrP3F4 foram co-transfectadas com STI1-YFP e PIAS1-myc (D) e STI1-YFP, PIAS1-myc e SUMO1-CFP (E) ou SUMO3-Flag (F). Após quarenta e oito horas as células transfectadas foram submetidas a imunomarcação utilizando-se os anticorpos anti-myc para detecção de PIAS1 (Sigma, 1:100) e anti-Flag para detecção de SUMO3 (Sigma, 1:200). O painel A representa a expressão independente das proteínas alvo. A co-transfecção de PIAS1 com SUMO1 (B) ou SUMO3 (C) foi utilizada como controle do experimento. PIAS1 induziu aumento na expressão de STI1 no núcleo por si só, e também na presença de SUMO1 ou SUMO3 (D, E, F). A quantificação da fluorescência nuclear foi feita no programa Metamorph e os resultados normalizados pela expressão citoplasmática de cada célula. Os resultados mostram a média ± SD de 4 experimentos independentes e foram comparados utilizando-se Test t-student. Foram utilizadas um mínimo de 50 células para quantificação. * representa diferença estatística, p < 0.0053 para STI1 e PIAS1; p < 0.0002 para STI1, PIAS1 e SUMO1; p < 0.0001 para STI1, PIAS1 e SUMO3. Barra: 20 m.

G

CAPÍTULO I: RESULTADOS

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Figura 9: Avaliação da distribuição intracelular de STI1 na presença de PIASy.

Células PrP3F4 foram co-transfectadas com STI1-YFP e PIASy-myc (D) e STI1-YFP, PIAS1-myc e SUMO1-CFP (E) ou SUMO3-Flag (F). Após quarenta e oito horas as células transfectadas foram submetidas a imunomarcação utilizando-se os anticorpos anti-myc para detecção de PIASy (Sigma, 1:100) e anti-Flag para detecção de SUMO3 (Sigma, 1:200). O painel A representa a expressão independente das proteínas alvo. A co-transfecção de PIASy com SUMO1 (B) ou SUMO3 (C) foi utilizada como controle do experimento. PIASy só produziu alteração na distribuição de STI1 na presença de SUMO3 (F). A quantificação da fluorescência nuclear foi feita no programa Metamorph e os resultados normalizados pela expressão citoplasmática de cada célula. Os resultados mostram a média ± SD de 4 experimentos independentes e foram comparados utilizando-se Test t-student. Foram utilizadas um mínimo de 40 células para quantificação. * representa diferença estatística, p < 0.0007. Barra: 20 m.

Diferente do observado para PIAS1, a expressão de PIASy por si só ou na presença de SUMO1 não levou ao aumento da localização de STI1 no núcleo (Figura 9D, E). Esses resultados sugerem especificidade de PIAS1 como E3 ligase para STI1. A co-expressão de PIASy e SUMO3 levou ao translocação de STI1 para o núcleo (Figura 9F). Porém, como SUMO3 por si só já altera a distribuição de STI1 é provável que esse efeito não tenha sido mediado por PIASy e sim por SUMO3.

É interessante notar que PIASy teve a sua distribuição alterada em células co-transfectadas com STI1 e SUMO. Comparado com seu padrão de distribuição sozinha ou na presença de SUMO1, quando STI1 foi super expressa PIASy formou vários grânulos que se distribuíram por todo núcleo, co-localizando com SUMO1. Tendo em vista que PIASy pode ser modificada por SUMO1 (Ihara et al., 2005), é possível que STI1 esteja participando desse processo.

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