Critérios de inclusão: Será estabelecido como critério de inclusão que os voluntários com idade entre 25 e 35 anos, que apresentem boa saúde geral e saúde bucal e que não tomem medicamentos regularmente ou que tenham tomado antibióticos por pelo menos dois meses antes da coleta de saliva. A análise da saúde bucal será realizada através de exame clínico intra-bucal por cirurgião dentista (VAA) no consultório de pesquisa clínica da Área de Bioquímica (Departamento de Ciências Fisiológicas) da FOP/UNICAMP, para confirmar a ausência de lesões da cárie ativas ou de doença periodontal. Os voluntários também deverão ser estudantes de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP). As justificavas para seleção deste grupo incluem : 1) facilidade de padronização da faixa etária, uma vez que geralmente os pós -graduandos estão dentro da faixa etária escolhida para este projeto; 2) facilidade para esclarecer os participantes sobre os objetivos e outros aspectos da pesquisa, porque os alunos de pós -graduação apresentam maior facilidade para compreensão de estudos científicos e sobre os benefícios gerados a médio e longo prazo a partir de seus resultados; 3) facilidade para o recrutamento e agendamento das coletas de amostra, pois os pós-graduandos frequentam a FOP-UNICAMP com regularidade e apresentam horários flexíveis. Estes terão ainda fácil acesso ao grupo de pesquisa caso necessitem de alterações em datas de coleta de amostra; 4) os pós-graduandos apresentam maior disposição e comprometimento com o desenvolvimento de projetos de pesquisa.
Critérios de exclusão: Serão excluídos da pesquisa, adultos com problemas de saúde geral ou bucal. Também serão excluídos voluntários que tenham feito uso de medicamentos até 2 meses antes da coleta. Cepas e condições de cultivo: A cepa SK36 isolada da placa dental foi escolhida como referência da espécie S. sanguinis, porque além de ser competente para manipulação genética, tem o genoma conhecido (Xu et al., 2007) e foi caracterizada quanto à formação de biofilmes por nosso grupo (Moraes et al., 2014;Camargo et al., 2018) e por outros grupos com expertise nesta espécie bacteriana (Zhu et al., 2018b). Mutantes isogênicos de srpA, gtfP, spxB, ssa_0094, iga serão obtidos na cepa SK36, através da recombinação homóloga dos loci destes genes com os respectivos alelos mutados, conforme descrito em estudos anteriores (Moraes et al., 2014;Camargo et al., 2018). Serão utilizadas também, 5 cepas de S. sanguinis isoladas de pacientes com bacteremia (SK330, SK353, SK1056, SK1059, SK678) e 4 cepas isoladas de biofilmes dentários (SK72, SK115, SK150, SK160), as quais foram gentilmente cedidas pelo Dr. Mogens Kilian do Institute of Medical Microbiology and Immunology, Aarhus University, Aarhus, Dinamarca. Os genomas destas cepas foram sequenciados e estão em fase de anotação no GenBank, (http://www.
13.414-903
(19)2106-5349 E-mail: [email protected]
Endereço:
Bairro: CEP:
Telefone:
Av.Limeira 901 Caixa Postal 52 Areião
UF:SP Município: PIRACICABA
Fax: (19)2106-5349
PIRACICABA DA
Continuação do Parecer: 3.365.892ncbi.nlm.nih.gov/genome/). Estas cepas são, portanto, bem conhecidas e disponibilizadas mundialmente para uso irrestrito pela comunidade científica, sem necessidade de pagamento (exceto pelos custos de envio), uma vez que não consistem em produto de valor comercial. Estas cepas foram gentilmente cedidas pelo Dr. Mogens Kilian, da instituição de origem, o que não implica em qualquer atividade de colaboração ou obrigação. As cepas foram enviadas por FedEx Corporation (empresa estrangeira de remessa expressa de correspondência, documentos e objetos) com destino a Faculdade de Odontologia de Piracaciba em nome da Profa. Dra. Renata de Oliveira Mattos Graner. As cepas serão mantidas a -70oC e reativadas a partir dos estoques congelados em ágar Brain Heart Infusion (BHA) (Merck Labs, Alemanha). Após o crescimento (48 h; 37oC; 10 % CO2), colônias isoladas serão inoculadas em 5 ml de caldo Brain Heart Infusion (BHI) (Merck Labs) ou meio quimicamente definido (MQD) (Camargo et al., 2018) e incubadas sob as mesmas condições durante 16 h. Estas culturas terão as absorbâncias (A550nm) mensuradas e inóculos ajustados pelas absorbâncias transferidos para meios fresco acrescido ou não de 1% de sacarose (único substrato para a produção de glucanos) e incubados nas mesmas condições até atingir A550nm igual a 0,3, correspondente à fase log de crescimento. Para a manutenção das cepas mutantes, os meios serão suplementados com eritromicina (5 g/ml).
Para utilização das cepas mutantes (Organismos Geneticamente Modificados – OMG) será submetido formulário à Comissão Interna de Biossegurança da FOP (CIBio – FOP), para autorização de atividades em contenção com OMG de acordo com às Resoluções Normativas da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio).
Construção das cepas mutantes isogênica dos genes srpA, gtfP, spxB, ssa_0094 e iga: Mutantes isogênicos de srpA, spxB, gtfP, ssa_0094 e iga serão obtidos a partir da cepa referência SK36, utilizando-se de recominação homóloga com alelo mutado construído através de estratégia de PCR e ligação, como descrito em nossos estudos anteriores (Moraes et al., 2014; Camargo et al., 2018), com algumas modificações. Nos alelos de DNA recombinante, as sequências codificadoras dos genes a serem removidos serão substituídas pelo gene de resistência à eritromicina obtido do plasmídeo pVA838 (erm r ). Para a confecção dos alelos mutados, o DNA genômico de SK36 será purificado a partir de 15 ml de cultura em BHI. O DNA plasmidial será purificado de culturas de E. coli contendo pVA838, através de extração alcalina e tratamento com fenol- clorofórmio. As reações de PCR serão realizadas com TaqDNA polimerase de alta fidelidade com atividade proof reading (Taq DNA Polymerase High Fidelity, Thermo Fisher Scientific, EUA). A qualidade das reações e tamanhos de fragmentos esperados serão monitorados em géis de agarose corados com brometo de etídio. Os produtos de PCR serão purificados utilizando-se StrataPrep PCR Purification
13.414-903
(19)2106-5349 E-mail: [email protected]
Endereço:
Bairro: CEP:
Telefone:
Av.Limeira 901 Caixa Postal 52 Areião
UF:SP Município: PIRACICABA
Fax: (19)2106-5349
PIRACICABA DA
Continuação do Parecer: 3.365.892Kit (Stratagene, E.U.A.), segundo as recomendações do fabricante.
Resumidamente, as regiões que flanqueiam os genes a serem removidos do genoma de SK36 (srpA, gtfP, spxB, ssa_0094, gtfP) serão amplificadas com pares de primers específicos (designados P1-P2 e P3-P4). Os primers P2 e P3 deverão conter na sua extremidade 5’, as sequências dos sítios de restrição das endonucleases AscI e XhoI (New England BioLabs, EUA) , respectivamente. Amplicons com o gene erm r serão obtidos a partir de pVA838 em reações de PCR com primers E1 e E2, os quais conterão nas extremidades 5’, os sítios de restrição de AscI e XhoI, repectivamente. Os amplicons obtidos com os pares de primers P1/P2, P3/P4 e E1/E2 serão purificados, digeridos com as endonucleases AscI e XhoI e a seguir purificados e ligados utilizando-se a enzima DNA ligase T4 (Thermo Fisher Scientific), segundo as recomendações do fabricante. Os produtos das reações de ligação serão então utilizados como DNA molde de reações de PCR com os primers P1 e P4 de cada gene, para gerar múltiplas cópias dos fragmentos recombinantes P1-erm r -P4. A estrutura dos alelos será checada através de reações de PCR com combinações dos primers P1/E2, E1/P4, P1/P2, P3/P4 e E1/E2).
Para obtenção das cepas mutantes, o total de 10 g dos fragmentos recombinantes purificados será utilizado para transformação natural da cepa SK36, como descrito anteriormente (Moraes et al., 2014). Os transformantes recuperados de culturas em BHA acrescido de eritromicina serão então isolados e a correta recombinação homóloga com os alelos mutados confirmada através de reações de PCR com os pares de primers para cada gene (P1/E2, E1/P3, P1/P4, P1/P2, P3/P4 e E1/E2). Para cada gene, um transformante com correta inserção do respectivo alelo mutado terá então seu DNA cromossômico purificado e o locus mutado analisado através de sequenciamento. Os mutantes obtidos serão estocados a -70 ºC e a -20 ºC em Skim milk (Difco). Para gerar os mutantes complementados, cada mutante isogênico será transformados com plasmídeo pDL278 contendo cópia intacta do respectivo gene removido do cromossomo (Moraes et al., 2014). O plasmídeo pDL278 tem origem de replicação para estreptococos e contém gene de resistência à espectinomicina, antibiótico que será utilizado como marcador. As cepas complementadas serão utilizadas como controles em todas as análises fenotípicas dos respectivos mutantes,para nos certificarmos de que a remoção dos genes estudados não promoveu modificações secundárias no genoma ou na transcrição de outros genes que possam alterar as características fenotípicas analisadas.
Seleção dos voluntários para coleta da saliva: Serão selecionados seis voluntários sadios, adultos, com idade entre 25 e 35 anos, e com boa saúde bucal, incluindo-se ausência de lesões de cárie e de doença periodontal, entre as pessoas atuando na pós-graduação da FOP-UNICAMP, três de
13.414-903
(19)2106-5349 E-mail: [email protected]
Endereço:
Bairro: CEP:
Telefone:
Av.Limeira 901 Caixa Postal 52 Areião
UF:SP Município: PIRACICABA
Fax: (19)2106-5349
PIRACICABA DA
Continuação do Parecer: 3.365.892cada gênero. A seleção dos voluntários para estudo será realizada após a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba conforme definido na Resolução nº 466/12, relativo à pesquisa com seres humanos.
Coleta de saliva humana: Amostras de saliva total humana estimulada serão coletadas de cada voluntário, conforme protocolo descrito por (Henson et al., 2010), com algumas modificações. As coletas serão realizadas pelo período da manhã (9 – 9,5 h), devendo o voluntário não ter ingerido alimentos, medicamentos ou realizado procedimentos de higiene bucal por 2 h antes da coleta. Após enxague bucal com água destilada durante 1 min, serão aguardados 5 min. para a estimulação da salivação através da mastigação um pedaço padronizado de Parafilm®, e coleta de um total de 10 ml de saliva em tubo de vidro esterilizado, o qual será mantido em banho de gelo. As amostras de saliva serão processadas imediatamente após a coleta, sendo primeiramente acrescidas de ditiotreitol (DTT) a 2,5 mM (para permitir a filtração) (Camargo et al., 2018), clarificadas por centrifugação (17.000 x g, 15 min., 4oC) e esterilizadas por filtração sob vácuo, em filtros de baixa adsorção de proteínas com poros de 0,22 um de diâmetro (Nalgene). Alíquotas das amostras serão então mantidas em tubos de vidro a -70oC até o momento do uso. Estas amostras serão identificadas por números arbitrários anotados no caderno de experimento de um dos pesquisadores deste projeto (GNCS).
Análises da formação inicial de biofilmes através de microscopia eletrônica de varredura (MEV): As fases iniciais de formação de biofilmes pelas cepas estudadas serão analizadas através de MEV, como descrito anteriormente (Moraes et al., 2014), com mínimas modificações. Resumidamente, lamínulas de vidro serão tratadas com saliva humana estéril por 18h (4oC) e transferidas horizontalmente para poços de placas de 24 poços contendo diluições 1:10 de culturas de S. sanguinis em BHI ou MQD (A550nm 0,3), em meio fresco acrescido de 10% de saliva e suplementado ou não de 1% de sacarose. As placas serão incubadas por 4h a 37oC, sob atmosfera de 10% CO2, para a formação de biofilmes. As seguir, as lamínulas serão gentilmente lavadas com PBS (pH 7,4) e processadas para microscopia eletrônica da varredura. Imagens digitais dos biofilmes serão obtidas em microscópio eletrônico de varredura (JSM 5600LV; JEOL, Japão) disponível no Centro de Microscopia e Imagens (CMI) da FOP-UNICAMP. As absorbâncias (A550nm) das culturas bacterianas de cada poço também serão determinadas, para o monitoramento do crescimento planctônico. Serão realizados pelos menos três experimentos independentes
Análises de biofilmes maduros em placas de poliestireno: Para comparar a maturação de biofilmes entre a cepa parental e as mutantes isogênicas, será quantificada a biomassa de biofilmes formados por estas cepas em placas de poliestireno durante 18h, como descrito em estudo
13.414-903
(19)2106-5349 E-mail: [email protected]
Endereço:
Bairro: CEP:
Telefone:
Av.Limeira 901 Caixa Postal 52 Areião
UF:SP Município: PIRACICABA
Fax: (19)2106-5349
PIRACICABA DA
Continuação do Parecer: 3.365.892anterior (Camargo et al., 2018). Para isto, serão realizadas diluições (1:10) de culturas das cepas em BHI ou MQD (com A550nm 0,3) em meio fresco contendo 10% de saliva estéril, suplementado ou não com 10% de saliva. Volumes de 200 µl destas diluições serão transferidos em sextuplicata para placas de poliestireno de 96 poços (Cral Plast, Cotia, SP). Poços com o mesmo meio de cultura sem o inóculo bacteriano serão utilizadas como controle negativo. As placas serão então incubadas a 37oC, sob atmosfera de 10% CO2, durante 18h. A seguir, alíquotas das suspensões serão transferidas para outra placa de 96 poços, para o monitoramento do crescimento planctônico através da leitura das absorbâncias. Os biofilmes serão então lavados com água destilada por três vezes, para remoção das células pobremente aderidas, e a seguir, corados com violeta cristal a 1% durante incubação a temperatura ambiente (30 min.). Após nova série de lavagens, os biofilmes serão secos sob temperatura ambiente, durante 1 a 2 h. O corante dos biofilmes será então solubilizado em volumes de 200 µl de etanol durante incubação por 30 min. a temperatura ambiente. Volumes de 100 µl do corante eluído serão transferidos para novas placas para leitura da A575nm, como medida indireta de biomassa dos biofilmes. Pelo menos três experimentos independentes serão realizados. Análises de biofilmes de 4 a 18 h através de microscopia confocal. Os biofilmes para as análises de microscopia confocal serão realizados como descrito por (Liu et al., 2017), com algumas modificações. Culturas de 16 h das cepas SK36 e respectivos mutantes isogênicos em BHI ou MQD serão diluídas (1:10) em meio fresco suplementado com 10% de saliva estéril e contendo ou não 1% de sacarose. Estas diluições serão transferidas para placas de 24 poços e incubadas a 37oC (sob atmosfera de 10% de CO2) durante 4, 18* e 24h. A seguir, os fluídos de cultura serão transferidos para outras placas, para monitoramento do crescimento planctônico, através da determinação das medidas de A550nm. Os biofilmes serão então gentilmente lavados com PBS (pH 7,4) e corados com 1,5 µM Syto 9 (ThermoFisher Scientifc, E.U.A.) durante 25 min. Após remoção do corante, os biofilmes serão gentilmente lavados com PBS e visualizados em microscópio confocal TCS SP5 (Leica), disponível no CMI da FOP-UNICAMP. Células coradas por Syto 9 serão visualizadas através da excitação a 488 nm, utilizando-se filtros para comprimentos de onda de 493 a 559 nm. As imagens obtidas em diferentes secções Z serão capturadas e analisadas utilizando-se o software Image J. Serão analisados biofilmes formados em três experimentos independentes.
Análise dos dados: Os biofilmes formados durante 4h sobre lamínulas de vidro, serão analisados a partir de imagens digitais obtidas em aumento de 1.300 vezes, as quais serão obtidas em 32 áreas pré-determinadas (96 x 63 µm) igualmente distribuídas sobre as lamínulas de vidro. Estas
13.414-903
(19)2106-5349 E-mail: [email protected]
Endereço:
Bairro: CEP:
Telefone:
Av.Limeira 901 Caixa Postal 52 Areião
UF:SP Município: PIRACICABA
Fax: (19)2106-5349
PIRACICABA DA
Continuação do Parecer: 3.365.892imagens serão analisadas com auxílio do programa ImageJ Image Processing and Analysis software in Java (NIH, http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html), para determinação do tamanho das áreas das lamínulas recobertas por biofilmes obtidas de dois experimentos representativos (total de 64 imagens). O mesmo programa será utilizado, para comparação das medidas de profundidade (µm) e coeficientes de rugosidade obtidos por microscopia confocal. Os valores de área e biomassa obtidos nas análises de MEV e confocal e as medidas de absorbância dos biofilmes obtidas em placas de microtitulação serão comparados entre as cepas, utilizando-se teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn, ou através de análises de Mann-Whitney, nas quais cada cepa mutante será comparada individualmente à cepa parental SK36. As diferenças serão consideradas estatisticamente significantes, quando valores de p forem inferiores a 0,05. Resultados esperados: Espera-se com este estudo, elucidar o papel dos genes srpA, spxB, gtfP, ssa_0094 e iga nos diferentes estágios de formação do biofilme de S.sanguinis. É possível que os produtos codificados por esses genes sejam importantes para a dinâmica de formação de biofilme de S.sanguinis desde a adesão inicial até a maturação, uma vez que essas enzimas estão relacionadas com a degradação de componente do sistema imune presente na película adquirida e com o aumento da biomassa. Portanto, compreender as funções destes genes no processo de formação de biofilme S.sanguinis é importante para o desenvolvimento de estratégias de controle de biofilmes dentários.
Local de realização da pesquisa: A pesquisa será realizada na Faculdade de Odontologia de Piracicaba – FOP na Área de Microbiologia e Imunologia do Departamento de Diagnóstico Oral. Os ensaios serão realizados no Laboratório de Biologia Molecular e no Laboratório de Cultura de Células, ambos localizados na Área de Microbiologia e Imunologia. Adicionalmente será utilizado o Centro de Microscopia e Imagem da FOPUNICAMP. Os exames clínicos serão realizados na área de Bioquímica da FOP-UNICAMP.
O cronograma proposto para a pesquisa no projeto informa o início em 2019, o término em 2021 e prevê cerca de 36 meses para conclusão do estudo. O cronograma descrito na PB indica que a pesquisa será iniciada em 01/06/2019 e será concluída em 17/12/2021, em cerca de 31 meses.
A LISTA DE PESQUISADORES CITADA na capa do projeto de pesquisa inclui Victor Aragão Abreu de Freitas (Cirurgião-Dentista, Doutorando no PPG em Biologia Bucodental, Área de Microbiologia e Imunologia, da FOP/UNICAMP, Pesquisador responsável), Johnny Naoki Soares (Graduando no curso de Odontologia da FOP/UNICAMP, Pesquisador participante), Isabela Camargo Graduanda no curso de Odontologia da FOP/UNICAMP, Pesquisadora participante), Eduardo Martinelli Franco (Biólogo, Mestrando no PPG em Biologia Bucodental, Área de Microbiologia e Imunologia, da
13.414-903
(19)2106-5349 E-mail: [email protected]
Endereço:
Bairro: CEP:
Telefone:
Av.Limeira 901 Caixa Postal 52 Areião
UF:SP Município: PIRACICABA
Fax: (19)2106-5349
PIRACICABA DA
Continuação do Parecer: 3.365.892FOP/UNICAMP, Pesquisador participante), Geovanny Nilton Cuya Salvatierra (Cirurgião-Dentista, Mestrando no PPG em Biologia Bucodental, Área de Microbiologia e Imunologia, da FOP/UNICAMP, Pesquisador participante), Lívia Araujo Alves (Cirurgiã-dentista, Pós-doutoranda no Departamento de Diagnóstico Oral da FOP/UNICAMP, Pesquisadora participante) e Renata de Oliveira Mattos-Graner (Cirurgiã-dentista, Docente do Departamento de Diagnóstico Oral da FOP/UNICAMP, Pesquisadora participante), o que é confirmado na declaração dos pesquisadores e na PB.
HIPÓTESE: Estudos prévios do nosso grupo revelaram dois sistemas reguladores de transcrição de dois componentes (SDC) que modulam a formação de biofilmes por S. sanguinis, os SDCs VicRK e SptRS (Moraes et al., 2014;Camargo et al., 2018). Como SDCs típicos, ambos estes sistemas são formados por uma proteína sensora de membrana histidina quinase, a qual ao detectar sinais ambientais específicos, se auto-fosforila no resíduo de histidina específico e transfere o grupo fosfato para a segunda proteína do sistema, o regulador de resposta cognato intra-citoplasmático. Ao ser fosforilado, este regulador de resposta assume uma conformação capaz de se ligar às sequências reguladoras dos genes alvo, os quais tem sua transcrição ativada ou reprimida (Mattos-Graner and Duncan, 2017). A inativação de ambos os SDC VicRK e SptRS na cepa S. sanguinis SK36 altera significativamente a formação de biofilmes. A inativação de VicRK reduz a formação de biofilmes associada à inibição da transcrição dos genes spxB e gtfP, ssa_0094, enquanto que a inativação de SptRS promove o aumento da formação de biofilmes associada ao aumento significativo da transcrição dos genes spxB e iga. Portanto, análises destes dois SDCs reforçam a hipótese de que os genes spxB, gtfP, ssa_0094 e iga participam de forma coordenada na formação de biofilmes por S. sanguinis. Análises da participação destes genes na formação e maturação de biofilmes de S. sanguinis poderá portanto gerar informações importantes para a compreensão dos mecanismos moleculares de formação de biofilmes por esta espécie.
OBJETIVO PRIMÁRIO: Investigar a influência dos genes de S.sanguinis potencialmente envolvidos na produção de eDNA e de expolissacarídeos (srpA, spxB, gtfP, ssa_0094 e iga) na capacidade de S.sanguinis formar biofilmes.
OBJETIVOS SECUNDÁRIOS: 1) Avaliar o efeito da inativação dos genes srpA, spxB, gtfP, SSA_0094 e iga na capacidade da cepa S. sanguinis SK36 de iniciar biofilmes in vitro sobre superfícies recobertas com saliva humana em meio de cultura complexo (BHI) e meio quimicamente definido (MQD) suplementado ou não com 0,1% de sacarose.2) Avaliar o efeito da inativação dos genes srpA, spxB, gtfP, SSA_0094 e iga, na maturação de biofilmes formados in vitro pela cepa SK36 durante 18 h, na presença de saliva humana, sob as mesmas condições nutricionais indicadas no
Objetivo da Pesquisa: 13.414-903 (19)2106-5349 E-mail: [email protected] Endereço: Bairro: CEP: Telefone:
Av.Limeira 901 Caixa Postal 52 Areião
UF:SP Município: PIRACICABA
Fax: (19)2106-5349
PIRACICABA DA
Continuação do Parecer: 3.365.892objetivo específico 1. 3) Avaliar o efeito da inativação dos genes srpA, spxB, gtfP, SSA_0094 e iga em SK36 na quantidade de biomassa e na estrutura tridimensional de biofilmes formados in vitro na presença de saliva humana sob as condições nutricionais indicadas no objetivo 1.
Quanto aos riscos e desconfortos previstos para os participantes, os pesquisadores informaram que “Não há riscos previsíveis, exceto a possível fatiga muscular para estímulo da mastigação. Isto será minimizado, porque a saliva será coletada durante tempo máximo de 10 min. O pesquisador envolvido na coleta de saliva deverá ser previamente treinado para aplicar os procedimentos de coleta salivar. Os laboratórios da