A planta Duguetia furfuracea (St. Hil.) Benth e Hook. f. (1862), pertence à família Annonaceae, é conhecida popularmente como sofre‐do‐rim‐quem‐quer, araticum‐do‐ cerrado e ata‐do‐mato. Esta planta ocorre em vários estados brasileiros, como Amazonas, Bahia, Distrito Federal, Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e São Paulo. É comumente utilizada pela população como anti‐reumática e para combater cólicas renais. Estudos anteriores têm descrito a atividade terapêutica da planta com ação tripanomicida, antiprotozoárica e antiplasmódica. Devido à grande utilização da planta D. furfuracea pela população, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as atividades genotóxica/mutagênica, antigenotóxica/antimutagênica e citotóxica do extrato liofilizado de folhas de D. furfuracea pelo teste de indução do profago λ (Induteste) em cepas de E. coli e pelo teste do micronúcleo em medula óssea de camundongos (Teste do Micronúcleo). O teste de indução do profago λ foi realizado de acordo com Moreau et al. (1976), utilizando as cepas de E. coli WP2s(λ) e RJF013. Para a avaliação das atividades genotóxica e tóxica foram empregadas as doses de 1 mg, 2 mg, 5 mg e 10 mg, enquanto que na avaliação da ação antigenotóxica foram testadas as doses de 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 5 mg e 10 mg co‐ tratadas com 0,5 µg de mitomicina C. O teste do micronúcleo em medula óssea de camundongos foi realizado de acordo com a metodologia de Schmid (1975). Para a avaliação da atividade mutagênica, os animais foram tratados com três diferentes doses do extrato da planta (100, 200 e 300 mg/Kg p.c.), enquanto que para a avaliação da atividade antimutagênica foram administradas as mesmas doses (100, 200 e 300 mg/Kg p.c.) concomitantemente de uma dose de 4 mg/Kg de mitomicina C. A genotoxicidade foi avaliada pela freqüência de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) e a citotoxicidade foi analisada pela razão eritrócitos policromáticos e normocromáticos (EPC/ENC). Os resultados obtidos na avaliação da mutagenicidade mostraram que todas as doses do extrato de D. furfuracea não aumentaram significativamente o número de EPCMN (p>0,05), quando comparados com o grupo controle negativo. A citotoxicidade foi evidente em todas as doses testadas (p<0,05). Em relação à antimutagenicidade, todas as doses administradas reduziram significativamente a freqüência de EPCMN, em relação ao grupo controle positivo (p<0,05). Em ambos os testes, os resultados obtidos mostraram‐se concordantes, nos quais o extrato de D. furfuracea apresentou atividade citotóxica; porém, não demonstrou
atividade genotóxica em bactérias e ação mutagênica em camundongos. Por outro lado, foi observada ação antigenotóxica e antimutagênica.
ABSTRACT
The plant Duguetia furfuracea (St. Hil.) Benth and Hook. f. (1862), belongs to the family Annonaceae, is popularly known as sofre‐do‐rim‐quem‐quer, araticum‐do‐cerrado and ata‐do‐mato. This plant occurres in several Brazilian states, as Amazonas, Bahia, Distrito Federal, Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul and São Paulo. It is commonly used by people as anti‐rheumatic and to cure renal colic. Previous studies have described therapeutic activity of this plant with trypanocidal, antiplasmodial and antiprotozoal effects. Due to the large utilization of this plant by the local people, the present work aimed to evaluate the genotoxic/mutagenic, antigenotoxic/antimutagenic and cytotoxic activities of lyophilized leaf extract of D. furfuracea by the lisogenic induction test (Inductest) and the mice bone marrow micronucleus assay (Micronucleus Test). The lisogenic induction test was performed according Moreau et al., (1976) using E. coli WP2s(λ) and RJF013 strains. To evaluate the genotoxic and toxic activities, the doses employed were 1 mg, 2 mg, 5 mg e 10 mg, while to evaluate the antigenotoxic action the doses were of 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 5 mg e 10 mg co‐treated with 0,5 µg de mitomycin C. Micronucleus test in the bone marrow of mice was performed according to Schmid (1975). To evaluate mutagenic activity, mice were treated with three different doses of plant extract (100, 200 and 300 mg/Kg body weight), to evaluate antimutagenic activity, mice were treated with the same doses co‐administered with 4 mg/kg of mitomycin C. The genotoxic action was evaluated by the frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) and cytotoxicity was evaluated by the polychromatic and normochromatic erythrocytes ratio (PCE/NCE). The results obtained from the evaluation of mutagenicity of this plant showed that the extract of D. Furfuracea didn’t increase significantly (p>0.05) the frequency of MNPCE compared to negative control. Cytotoxicity was evident in all applied doses (p<0.05). Concerning antimutagenicity, all doses of extract reduced significantly the frequency of MNPCE compared to the positive control group (p<0.05). In both tests, the results obtained demonstrated that the extract of D. furfuracea presented cytotoxicity; however, it didn’t show genotoxic or mutagenic effects in bacteria and mice bone marrow respectively. In the other hand, it was observed a antigenotoxic and antimutagenic action.
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1. Câncer e Fitoterapia
O câncer é uma das doenças que mais causam temor na sociedade, por ter se tornado um estigma de mortalidade e dor. Na verdade, a palavra câncer, de origem latina (cancer) significando “caranguejo”, deve ter sido empregada em analogia ao modo de crescimento infiltrante, que pode ser comparado às pernas do crustáceo, que as introduz na areia ou lama para se fixar e dificultar sua remoção (Almeida et al., 2005).
Atualmente, a definição científica de câncer refere‐se ao termo neoplasia, especificamente aos tumores malignos, pelo crescimento descontrolado de células transformadas. Existem quase 200 tipos que correspondem aos vários sistemas de células do corpo, os quais se diferenciam pela capacidade de invadir tecidos e órgãos, vizinhos ou distantes (Almeida et al., 2005).
Em 2005, de um total de 58 milhões de mortes ocorridas no mundo, o câncer foi responsável por 7,6 milhões, o que representou 13% de todas as mortes. Do total de óbitos por câncer ocorridos em 2005, mais de 70% ocorreram em países de média ou baixa renda (Organização Mundial da Saúde (OMS), 2006). No Brasil, as estimativas para o ano de 2008, válidas também para o ano de 2009, apontam que ocorrerão 466.730 casos novos de câncer. Os tipos mais incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres de próstata e de pulmão, no sexo masculino, e os cânceres de mama e de colo do útero, no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude observada no mundo (Figura 1) (INCA, 2007).
Os fatores de risco de câncer podem ser externos (ambientais) ou endógenos (hereditários) (INCA, 2007). A maioria dos casos (cerca de 80%) está relacionada ao meio ambiente, onde encontra‐se um grande número de fatores de risco. Entende‐se por ambiente, o meio em geral (água, terra e ar), o ambiente ocupacional (quando insalubre), o ambiente social e cultural (estilo e hábitos de vida) e o ambiente de consumo (alimentos, medicamentos). As mudanças provocadas no meio ambiente pelo próprio homem, os hábitos e estilos de vida adotados pelas pessoas podem determinar os diferentes tipos de câncer (Almeida et al., 2005).
Figura 1. Tipos de câncer mais incidentes, estimados para o ano de 2008, na população brasileira (INCA, 2007).
Em 2005, pesquisadores da Harvard School of Public Health, liderados por Goodarz Danaei, estimaram que 35% das mortes por câncer no mundo poderiam ser atribuídas ao efeito combinado de nove fatores de risco, separados em cinco grupos: dieta e inatividade física, substâncias aditivas (uso de tabaco e álcool), saúde sexual e reprodutiva (infecções sexualmente transmissíveis), riscos ambientais (poluição do ar, combustíveis sólidos, tabagismo passivo) e contaminação venosa pelo vírus da hepatite B e C (INCA, 2007).
Assim, tanto fatores de risco de câncer ambientais quanto hereditários, estão inter‐ relacionados e interagem de várias formas para dar início às alterações celulares presentes na etiologia do câncer (INCA, 2007). Tais alterações celulares que geram as neoplasias podem ocorrer em genes especiais denominados protooncogenes, que a princípio, são inativos em células normais. Quando ativados, os protooncogenes transformam‐se em oncogenes, responsáveis pela malignização (transformação) das células normais. Estas células diferentes são, então, denominadas cancerosas, ou melhor, tumorais. Essas células alteradas passam então a se comportar de forma anormal, multiplicando‐se de maneira descontrolada. Com a constante multiplicação celular, há a necessidade de que novos vasos sangüíneos sejam formados para que haja a nutrição destas células, em um processo denominado angiogênese. A manutenção e o acúmulo de massa dessas células formam os
tumores malignos e elas também podem adquirir a capacidade de se desprenderem do tumor e de migrarem, invadindo inicialmente os tecidos vizinhos, podendo chegar ao interior de um vaso sangüíneo ou linfático e, através destes, disseminarem‐se, chegando a órgãos distantes do local onde o tumor se iniciou, formando as metástases (Almeida et al., 2005). As células cancerosas são, geralmente, menos especializadas nas suas funções que as suas correspondentes normais. Conforme as células cancerosas vão substituindo as normais, os tecidos invadidos vão perdendo suas funções; assim, por exemplo, a invasão neoplásica dos pulmões gera alterações respiratórias; com isto há a disfunção orgânica que pode levar à falência do órgão ou, em casos mais graves, leva à morte do paciente. Cabe ressaltar que, na verdade, oncologia médica é a especialidade na medicina que foca o tratamento sistemático do paciente com câncer com quimioterapia e outros tipos de tratamento (Almeida et al., 2005).
Existem três tipos principais de tratamento para o câncer: cirurgia, radioterapia e quimioterapia (Murad, 1996). Mais recentemente tem‐se usado a terapia de fotorradiação com derivados hematoporfirínicos (HTP) (Machado, 2000) e a imunoterapia (Salmonm, 1998), sendo que o objetivo de cada um destes tratamentos é erradicar o câncer, normalmente por meio da terapia combinada, onde é associado mais de um tipo de tratamento (Almeida et al., 2005).
A técnica cirúrgica pode levar à remoção de tumores com eficácia, se não houver metástase; no caso da leucemia, por exemplo, costuma ser necessário o uso de outros tipos conjuntos de terapia, incluindo o transplante de medula. A radioterapia (geralmente raios gama, radioisótopos como cobalto‐60, raios‐X e até prótons e mésons pi negativos) é usada comumente em conjunto com a cirurgia, como incremento da eficiência do tratamento. Mesmo isoladamente, a radioterapia pode diminuir tumores grandes, diminuir a recorrência e a chance de metástase, sendo uma metodologia antineoplásica muito usada; entretanto, mesmo que sejam usados os sensitizadores (que diminuem os efeitos colaterais) o tratamento por radiação é sujeito a severas limitações (Murad, 1996).
Com esses métodos de tratamento citados, um terço dos pacientes consegue ser curado através de medidas locais (cirurgia ou radioterapia), que são eficazes quando o tumor ainda não sofreu metástase por ocasião do tratamento. Todavia, nos demais casos, a neoplasia caracteriza‐se pelo desenvolvimento precoce de micrometástases, indicando a
necessidade de uma abordagem sistêmica, que pode ser efetuada, em cerca de 60‐70% dos casos com a quimioterapia (Almeida et al., 2005).
O objetivo primário da quimioterapia é destruir as células neoplásicas, preservando as normais. Entretanto, a maioria dos agentes quimioterápicos atua de forma não‐específica, lesando tanto células malignas quanto normais (Murad, 1996; Salmonm, 1998), particularmente as células de rápido crescimento, como as gastrointestinais, capilares e as do sistema imunológico. Isto explica a maior parte dos efeitos colaterais da quimioterapia: náuseas, perda de cabelo e susceptibilidade maior às infecções (Machado, 2000; Oliveira, 2002).
Porém, o corpo recupera‐se destes inconvenientes após o tratamento, e o uso clínico desses fármacos exige que os benefícios sejam confrontados com a toxicidade, na procura de um índice terapêutico favorável (Murad, 1996; Salmonm, 1998). Muitos estudos estão sendo feitos para a maior eficiência da quimioterapia e a combinação de diversos agentes antineoplásicos, tendo‐se conseguido resultados surpreendentes com índices de cura de 75 a 90% em diversos tipos de câncer (Almeida et al., 2005).
Existe uma grande variedade de tipos de compostos utilizados em quimioterapia oncológica (Almeida et al., 2005), dentre eles encontram‐se compostos sintéticos e produtos naturais extraídos de plantas. Dentre alguns produtos naturais citotóxicos, usados clinicamente no tratamento de neoplasias, têm se os alcalóides vegetais (produtos naturais nitrogenados derivados biossinteticamente de aminoácidos) como: i) alcalóides da vinca (vimblastina e vincristina) (Oliveira, 2002) (Figura 2) – ação pela inibição do fuso mitótico, ligando‐se às proteínas microtubulares e, conseqüentemente, interrompendo a divisão celular na metáfase (Oliveira, 2002); ii) taxol (Figura 2), éster alcalóide derivado do teixo ocidental (Taxus brevifolia) e do teixo europeu (Taxus baccata), (conhecido comercialmente como Paclitaxel®)(Oliveira, 2002) – ação também pela inibição do fuso mitótico, dimerização da tubulina e estabilização dos túbulos, protegendo‐os da despolimerização, o que estabiliza, provoca o bloqueio da multiplicação celular, o que resulta na perda da viabilidade celular (Oliveira, 2002); iii) podofilotoxinas (ou epipodofilotoxinas) (Salmonm, 1998; Chabner & Calabresi, 1995), tendo‐se como exemplos principais a etoposida (VP‐16) e teniposida (VM‐26), (Figura 2), derivados semi‐sintéticos da podofilotoxina, extraída da raiz do podofilo (Podophyllum peltatum) (Salmonm, 1998; Chabner & Calabresi, 1995) – ação pelo bloqueio das células nas fases S e G2 e inibição da enzima topoisomerase II, o que promove lesão no
DNA. Pode‐se citar também o uso da enzima asparaginase (Lasparagina amino hidrolase, Elspar), particularmente em tratamento de leucemia aguda infantil (Machado, 2000; Chabner & Calabresi, 1995), isolada de várias bactérias, que atua pela diminuição catabólica de asparagina sérica, assim como dos níveis sangüíneos de glutamina. Nas células neoplásicas, isto provoca a inibição da síntese de proteínas, resultando no bloqueio da proliferação celular. Por último, é digno de nota ressaltar o uso recente de vacinas antitumorais, ainda em fase de teste, através da interação antígeno‐anticorpo visando a imunização do organismo (Jager et al., 2002). Figura 2. Estruturas de vimblastina, vincristina, etoposida, teniposida e Taxol (Almeida et al., 2005). Neste contexto é importante mencionar que as plantas, além de seu uso na medicina popular com finalidades terapêuticas, têm contribuído, ao longo dos anos para a obtenção de vários fármacos, até hoje amplamente utilizados na clínica (Farnsworth, 1980; Teske e Trentini, 1995).
Nos últimos anos tem‐se verificado um grande avanço científico envolvendo os estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais que visam obter novos compostos com propriedades terapêuticas. Isto pode ser claramente observado pelo aumento de trabalhos publicados nesta área, tanto em congressos como em periódicos nacionais e internacionais, além do surgimento de novos periódicos específicos sobre produtos naturais ativos, como Phytomedicine, Phytochemical Analysis, Natural Product Letter, etc. (Filho & Yunes, 1998).
Quando se procura obter substâncias ativas de plantas, um dos principais aspectos que deve ser observado consiste nas informações da medicina popular. Dados da literatura revelam que é muito mais provável encontrar atividade biológica em plantas orientadas pelo seu uso na medicina popular do que em plantas escolhidas ao acaso (Montellano, 1975; Farnsworth, 1981). Cerca de 75% dos compostos puros naturais empregados na indústria farmacêutica foram isolados seguindo recomendações da medicina popular (Silva Júnior & Vizzoto, 1996). Outros aspectos importantes que devem ser levados em consideração são as informações botânico‐taxonômicas e químico‐taxonômicas (Cordell, 1995; Júnior & Scheffer, 1994).
A fitoterapia constitui uma forma de medicina que vem crescendo visivelmente ao longo dos anos onde atualmente o mercado mundial de fitofármacos gira em torno de 15 bilhões de dólares. Talvez o principal fator a contribuir consideravelmente para o crescimento em questão consista na evolução dos estudos científicos, particularmente os estudos químicos e farmacológicos, que comprovam, cada vez mais, a eficácia das plantas medicinais, principalmente aquelas empregadas na medicina popular com finalidades terapêuticas (Filho & Yunes, 1998).
Entretanto, a necessidade de se chegar aos compostos puros responsáveis pelos efeitos biológicos apresentados pelos extratos, leva a uma obrigatória integração entre a química e a farmacologia molecular, cujo elo pode levar à obtenção de substâncias naturais ou sintéticas de grande interesse químico‐medicinal (Filho & Yunes, 1998).
Em nosso país, os estudos científicos envolvendo produtos naturais ativos, suas indicações e contra‐indicações, podem proporcionar aos fitofármacos um maior nível de aceitação médica, respaldados pela comprovação de sua eficácia terapêutica em experimentos farmacológicos pré‐clínicos e clínicos (Filho & Yunes, 1998).
Este fato é de extrema importância, considerando‐se que o Brasil se encontra atualmente nas primeiras posições no mercado mundial de fármacos, necessitando urgentemente que as indústrias de fitofármacos existentes se desenvolvam para competir inclusive a nível internacional. A instalação de indústrias envolvendo a síntese de fármacos a partir de produtos naturais poderia, assim, ser um considerável pólo de crescimento para a química e a farmacologia (Filho & Yunes, 1998). 1.2. Plantas Medicinais É provável que a utilização das plantas como medicamento seja tão antiga quanto o próprio homem. Numerosas etapas marcaram a evolução da arte de curar, porém, torna‐se difícil delimitá‐las com exatidão, já que a medicina esteve por muito tempo associada a práticas mágicas, místicas e ritualísticas. Consideradas ou não seres espirituais, as plantas, por suas propriedades terapêuticas ou tóxicas, adquiriram fundamental importância na medicina popular (Martins et al., 2000).
Contudo, as civilizações antigas muito contribuíram com o conhecimento das propriedades terapêuticas dos vegetais. Fragmentos de papiros médicos contendo instruções e receitas de como preparar vários medicamentos a partir de plantas medicinais datam de cerca de 2400 a.C. (Almassy Júnior et al., 2005). As civilizações da China, Índia e norte da África deixaram evidências escritas do uso de plantas para o tratamento de uma grande variedade de enfermidades (Phillipson, 2001). No Brasil, o conhecimento do uso das plantas medicinais é o resultado de uma miscigenação cultural envolvendo africanos,
europeus e indígenas, com introdução de espécies exóticas pelos colonizadores e escravos, (Engelke, 2003) desde seu descobrimento em 1500 (Petrovick, 1999).
Assim, os africanos utilizavam muito comumente o guiné (Petiveria alliacea L.) e o melão‐de‐são‐caetano (Momordica charantia L.), pois, entre os negros, quando alguém adoecia era porque estava possuído por espírito mau, e o curandeiro se encarregava, então, de expulsá‐lo por meio de exorcismo e pelo uso destas plantas (Almassy Júnior et al., 2005).
Já a influência européia no Brasil teve início com a chegada dos jesuítas, que trouxeram várias plantas medicinais, como camomila (Chamomilla recutita (L.) Rauschert),
melissa (Melissa officinalis L.), malva (Malva sylvestris L.), funcho (Foeniculum vulgare Mill.), alecrim (Rosmarinus offcinalis L.), a bardana (Arctium minus (Hill) Bernh.) e o dente‐de‐leão (Taraxacum officinale Weber). Por isso, a maioria das plantas medicinais de origem européia foi adaptada e tem‐se reproduzido espontaneamente no Brasil (Almassy Júnior et al., 2005).
Os índios utilizavam ipecacuanha (Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes), jaborandi (Pilocarpus jaborandi), guaraná (Paullinia cupana Kunth), taiuiá (Cayaponia spp.) e a erva‐de‐ bugre (Casearia sylvestris Sw.) na cura dos enfermos (Almassy Júnior et al., 2005).
Dessa forma, por meio da tentativa e do erro, pouco a pouco, os povos mais primitivos da história humana passaram a conhecer as plantas de seu ecossistema e a reconhecer suas propriedades, inclusive as medicinais. Tal conhecimento era repassado sucessivamente entre as gerações, principalmente pela tradição oral, fato este que continua ocorrendo até hoje em comunidades mais isoladas, ou que não desenvolveram a escrita (Almassy Júnior et al., 2005).
Esta relação entre povos e plantas é denominada de etnobotânica, que pode ser definida como o estudo das sociedades humanas, passadas e presentes, e todos os tipos de inter‐relações: ecológicas, evolucionárias e simbólicas; reconhecendo a dinâmica natural das relações entre o ser humano e as plantas (Azevedo & Kruel, 2007).
Comumente, as pesquisas etnobotânicas além de abordarem populações tradicionais, como indígenas e caiçaras, também se concentram em populações de cidades e de pequenos núcleos urbanos com origem rural. Nestas populações, tem sido observada a utilização das plantas como um dos poucos recursos terapêuticos para tratar suas doenças mais freqüentes (Pilla et al., 2006).
Atualmente, o tratamento das enfermidades humanas a partir de plantas medicinais, ou seus derivados, encontra‐se em expansão por todo o mundo (Farnsworth, 1997). Entretanto, durante muitos anos a pesquisa com plantas medicinais foi subestimada no meio científico, só tomando impulso recente e gradualmente, à medida que alguns estudos foram se mostrando promissores. Mas o número de espécies estudadas no Brasil, ao longo de mais de 40 anos de pesquisas com plantas medicinais ainda é reduzido (Pavan‐Fruehauf, 2000). Apesar do aumento de estudos nessa área, os dados disponíveis revelam que apenas 15 a 17% das plantas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal (Soejarto, 1996).
A Organização Mundial da Saúde estima que 80% das pessoas dependam da medicina tradicional, em especial nas nações em desenvolvimento (Farnsworth, 1997). O uso
de plantas medicinais, conhecido hoje como fitoterapia (Almassy Júnior et al., 2005) tem ressurgido como uma opção medicamentosa bem aceita e acessível aos povos, e no caso do Brasil é adequada para as necessidades locais de centenas de municípios brasileiros no atendimento primário à saúde. A expansão da fitoterapia pode ser atribuída a diversos fatores tais como: aos efeitos adversos de fármacos sintéticos, a preferência dos consumidores por tratamentos “naturais”, a validação científica das propriedades farmacológicas de espécies vegetais, o desenvolvimento de novos métodos analíticos colocados à disposição do controle de qualidade, o desenvolvimento de novas formas de preparações e administrações de produtos fitoterápicos, um melhor conhecimento químico, farmacológico e clínico das drogas vegetais e seus derivados, além, também, do menor custo se comparado com os fármacos sintéticos (Melo et al., 2007).
Além disso, o Brasil possui uma farmacopéia popular muito diversa baseada em plantas medicinais, visto que, o país é possuidor da maior diversidade vegetal do planeta, aproximadamente 55 mil espécies de plantas superiores (Engelke, 2003). Dentre as inúmeras plantas utilizadas na medicina popular a CEME (Central de Medicamentos do Ministério da Saúde) realizou a inclusão de dezenas de plantas brasileiras mais usadas popularmente.