Biliproteínas, também chamadas de ficobiliproteínas (Figura 4a) constituem um grupo de pigmentos encontrados naturalmente em cianobactérias, rodófitas (algas vermelhas eucarióticas), cryptomonadas (algas eucarióticas unicelulares biflageladas) e cianelas (organelas tipo plastídeos endossimbióticos) (SEKAR e CHANDRAMOHAN, 2008). Quando associadas, as ficobiliproteínas formam uma estrutura macromolecular chamada de ficobilissoma que são complexos protéicos que possuem a função de captação de luz e migração da energia ao PS II. Quando a energia absorvida pelas biliproteínas dos ficobilissomas alcança o centro de reação do PS II, ocorre a conversão da energia de excitação para energia química. As biliproteínas absorvem radiação em regiões do espectro visível onde a clorofila a tem baixa absorção. É importante que as biliproteínas absorvam fótons em uma vasta faixa de energias. As bilinas alcançam uma diversidade de absorção de luz devido às variações nos sistemas de ligações duplas conjugadas (MAcCOLL, 1998).
As bilinas são cadeias de tetrapirróis abertas que estão covalentemente ligadas a uma apoproteína por ligações tioéter a resíduos de cisteína (Figura 4b). Nas cianobactérias parece haver quatro tipos diferentes de bilinas: ficocianobilina, ficoeritrobilina, ficourobilina e ficoviolobilina. A ficocianina-C e a APC possuem as ficocianibilinas e a ficoeritrina-C possui a ficoeritrobilina (MAcCOLL, 1998). N H N N N CH3 O CH H H CH3 CH3 CH3 C2H5 O S CH3 C3H5O2 C3H5O2
Ficocianobilina ligada unicamente a proteína (PEC)
Ficoeritrina NH2 CYS PEB PEB 84 143 COOH CYS NH2 CYS CYS PEB 50 61 CYS PEB 84 CYS155 COOH PEB S CH3 C3H5O2 C3H5O2 CYS
Ficoeritrobilina ligada unicamente a proteína (PEB)
NH2 PCB COOH CYS 84 Ficocianina NH2 PCB CYS 84 COOH H N N N CH3 O CH H CH3 CH3 N H CH3 O CH CH2 NH2 COOH PCB CYS 84 Alfa Beta Alfa Beta Alfa CYS NH2 COOH PCB CYS 84 Beta PCB 155 Aloficocianina S CH3 C3H5O2 C3H5O2 CYS H N N N CH3 O CH H CH3 CH3 N H CH3 O CH CH3 S CYS
Ficoeritrobilina ligada duplamente a proteína (PEB)
Figura 4: Representações das ficobiliproteínas: (a) Estruturas das bilinas e (b) Esquemas mostrando o posicionamento das bilinas na sequência de aminoácidos da ficoeritrina,
ficocianina e aloficocianina. Fonte: MACCOL, 1998.
A ficocianibilina possui mais conjugação do que a ficoeritrobilina, portanto soluções de PC perto do pH neutro absorvem em energia mais baixa (máximo de 610 a 620 nm) do que a PE (máximo de 545 a 565 nm). A ficourobilina possui menos conjugação e sua absorção máxima é em 495 nm, em energia mais alta do que as ficoeritrobilinas (MAcCOLL, 1998).
Nas cianobactérias, a APC (azul) e a PC (azul) estão sempre presentes e a PE (vermelha) é encontrada em apenas algumas. A energia luminosa absorvida pela PE migra em seguida para a PC, e depois para a APC e finalmente para a clorofila a. As estruturas das ficobiliproteínas são similares na maioria das cianobactérias. As ficobiliproteínas estão
organizadas dentro de agregados macromoleculares conhecidos como ficobilissomas. A PC é o principal constituinte dos ficobilissomas enquanto que a APC funciona como pigmento ponte entre os ficobilissomas e lamelas fotossintéticas (PRASANNA et al., 2010). As ficobiliproteínas são estudadas atualmente por suas atuações como corantes naturais, como agentes fluorescentes em sistemas de detecção (por exemplo, citrometria de fluxo) e quanto às suas ações farmacológicas (SEKAR e CHANDRAMOHAN, 2008).
A PC é uma biliproteína hidrossolúvel de coloração azul. É produzida comercialmente a partir de cultivos, em larga escala, da cianobactéria A. platensis, sendo utilizada no Japão como corante natural. Seu principal uso é em alimentos, porém também é utilizado para ensaios imunológicos, microscopia e outras funções que precisam de fluorescência. A PC é também comercializada no Japão com o nome de Lina blue, um produto de coloração azul, inodoro, atóxico e levemente doce. Essa coloração está entre azul brilhante e índigo e é utilizado para colorir doces, sorvetes, produtos lácteos e bebidas. Essa mistura é estável em faixa de pH de 4,5 a 8,0 e a temperatura de até 60°C, porém é pouco estável à luz. Se o extrato de Arthrospira sp. for tratado com solvente orgânico, a PC será desnaturada e precipitada, obtendo-se um pigmento azul para utilização em sombras, lápis de olho e de lábios e batons, sendo atóxico para pele (COHEN, 1997). A PC foi adicionada a bebidas sem adição de calor (Pepsi® and Bacardi Brezzer®), que não perderam suas colorações por pelo menos 1 mês em temperatura ambiente. Sua coloração é muito estável em preparações secas. Flores de açúcar mantiveram sua coloração por muitos anos de armazenamento (SEKAR e CHANDRAMOHAN, 2008).
A produção de PC é afetada por vários fatores como quantidade e qualidade da luz utilizada (TAKANO et al., 1995). O meio utilizado para a produção comercial de biomassa de Arthrospira sp. para a produção de PC é mineral, constituindo um cultivo fotoautotrófico (VONSHAK, 1997). No entanto, alguns pesquisadores têm estudado a influência de cultivos mixotróficos sobre a produção de biomassa e PC nesta cianobactéria, verificando que a presença de glicose é capaz de incrementar a produção tanto de biomassa quanto de PC (CHEN e ZHANG, 1997; ZHANG et al., 1999; BORSARI et al., 2007). Um cultivo mixotrófico corresponde ao crescimento num meio onde a fonte de carbono é constituída por substâncias minerais e orgânicas. Fay (1983) descreveu que a luz promove a assimilação de substratos orgânicos pelas cianobactérias, provavelmente porque o ATP gerado na fotossíntese poderá ser usado para o transporte ativo do substrato orgânico através da membrana celular.
A PE é uma ficobiliproteína solúvel em água, de cor vermelha. A PE está associada a PC e APC, e difere em estrutura e propriedades, dependendo da espécie de alga ou cianobactéria. É encontrada tipicamente em classes evoluídas de rodófitas. A PE é um corante adequado para várias aplicações, devido às suas propriedades de absorção e emissão de luz. É utilizada como marcador fluorescente em análise, podendo, os materiais não tóxicos, serem
incluídos em cosméticos, usos farmacêuticos e alimentos (D’AGNOLO et al., 1994). Entretanto não há ainda a produção comercial de PE para uso em alimentos.
Os complexos antena da PE são encontrados em duas formas distintas, essas aumentam a absorção de luz nas regiões do verde ou azul do espectro da luz. As mais presentes são as PE de classe I (PEI), que contêm o cromóforo ficoeritrobilina (PEB, com absorbância máxima de 550 nm) de absorção na região do verde. Adicionalmente são encontradas as PE de classe II (PEII), estas sempre contêm a PEB e o cromóforo ficourobina absorvendo na região do azul-esverdeado (PUB, com absorbância máxima de 495 nm). Estas apoproteínas de PE são codificados pelo gen cpeBA a qual faz parte da base da PEI, ou o gen mpeBA que constitui a base de PEII. Quando uma espécie sintetiza tanto PEI e PEII, a apoproteína PEI pode também ligar o cromóforo PUB, mas cromóforos PUB são desconhecidos no PE do isolado marinho Synechococcus, pois não apresentam PEII (Six et al., 2007).
3.6.1 Aplicação de ficobiliproteínas de Arthrospira platensis como corante em alimentos
Antelo, Costa e Kalil (2008) estudaram a cinética de degradação térmica do extrato aquoso bruto de PC obtido de A. platensis. Para a determinação da cinética de degradação de PC, o efeito das temperaturas de 50, 53, 55, 57, 60, 62 e 65ºC, foi avaliado em extratos com pH 5,0; 6,0 e 7,0, de modo a obter-se a constante de velocidade de degradação (Kd) para cada condição proposta. Amostras foram coletadas até que se atingisse na solução, metade da concentração inicial da PC. Os valores de Kd obtidos em cada temperatura, para cada valor de pH, permitiu determinar a meia-vida da ficobiliproteína em cada condição. O modelo de cinética de degradação térmica do extrato aquoso bruto de PC foi validado como sendo de primeira ordem, de acordo com as correlações obtidas na determinação das constantes cinéticas de taxa de degradação de cada uma das temperaturas estudadas. Nas temperaturas entre 50 e 55ºC o extrato foi mais estável em pH 6,0 e entre 57 e 65ºC, em pH 5,0. Foi mostrado ser menos estável entre 50 e 65ºC quando em pH 7,0. Com objetivo de evitar a descoloração de extrato aquoso bruto de PC, devido à degradação da fração de proteína, foi realizada a adição de um agente estabilizador. Para a determinação da cinética de degradação de PC com adição de estabilizante, o sorbitol foi o estabilizador escolhido e foi adicionado em concentrações de 10, 20, 30, 40 e 50% (mg/mg) para o extrato incubado a 62ºC. A análise dos resultados obtidos para o extrato aquoso bruto de PC a valores de pH 5,0, 6,0 e 7,0, mostraram que os valores de meia-vida aumentaram, proporcionalmente, com a concentração de sorbitol adicionado ao extrato. Em pH 5,0, o valor da meia-vida do extrato bruto de PC a 62ºC foi de 5 minutos, sem a adição de um estabilizador, enquanto que a adição
de 10% de sorbitol proporcionou um aumento para 29 minutos. Este fato confirma que o sorbitol é um agente eficiente de estabilização de proteínas, retardando o processo de degradação da PC em concentrações maiores ou iguais a 10%.
Jespersen et al. (2005) avaliaram a estabilidade de diferentes corantes azuis. A solução de PC foi padronizada em pH 5 e 7 e a concentração de corante necessário foi cerca de 3,6 mg/mL para atingir uma absorbância de 0,8-1,2 a 616 e 620 nm, os dois máximos de absorção. No estudo de degradação térmica, a degradação de PC foi medida em espectrofotômetro a 45, 50 e 55ºC, em intervalos regulares, durante cinco horas, a 612- 620 nm (dependendo do pH da solução). A taxa de degradação aumentou com a temperatura, o pH 7 promoveu a maior degradação em qualquer temperatura. A mudança na absorbância foi maior dentro dos primeiros 40 minutos de aquecimento, seguido por uma degradação mais contínua, um padrão que pode indicar uma desnaturação inicial de proteína, pois também foi evidenciada o desenvolvimento de alguma turvação. Em estudos de degradação fotoquímica, as soluções foram irradiadas com luz monocromática a 313 nm e 600 nm, em experiências separadas, com medições regulares em espectrofotômetro. A PC em pH 5 e 7 mostrou degradação significativa após uma hora de exposição de luz a 313 nm de intensidade moderada, sendo mais sensível à degradação fotoquímica no pH 7 do que no pH 5, como também encontrado para a degradação térmica. PC em solução aquosa de pH 5 e 7 apresentou fotodegradação menor na luz de 600 nm, o que pode ser de alguma importância para a exposição à luz a longo prazo de bebidas. E foram realizados estudos acelerados de fotodegradação, onde uma lâmpada de xenônio acoplado a ventilação, com intensidade de luz de 480 W/m2, igual a 32.8000 lux, a degradação foi avaliada por medidas
espectrofotométricas, em intervalos regulares, por 24h. PC também foi mais estável em pH 5 do que em pH 7. A descoloração das amostras de PC foi observada apenas ao fim de seis horas. Após 24 horas, as soluções com pH 5 foram azul mais escuro, entretanto a coloração estava menos intensa, enquanto a solução com pH 7 apresentou-se quase sem cor, com um tom de roxo leve, após 24 horas. O precipitado foi observado em todas as amostras, depois de 24 horas, indicando a desnaturação de proteínas. Os autores concluíram que apesar da baixa estabilidade da PC frente a luz e altas temperaturas, comparado aos outros corantes azuis, ela parece ser o melhor corante natural alimentício azul. Os autores indicaram que a degradação do pigmento ocorre devido à sua alta sensibilidade à luz, podendo ser evitada por meio de um material de embalagem apropriado com boas barreiras de luz.
Estudo que avaliou a estabilidade de PC frente ao pH (2,5 a 13), durante um período de 4 semanas, indicou que a PC mostrou-se estável na faixa de pH entre 5,0 a 7,5, quando mantido à temperatura ambiente (25 ± 2ºC) e em temperatura refrigerada (9 ± 1ºC). À temperatura mais baixa (9 ± 1ºC), a PC manteve-se estável por períodos mais longos do que em temperatura ambiente, onde a temperatura mais fria apresentou leve alteração ao longo
das 30 dias e na temperatura ambiente, em torno de 5 dias, já apresentou alteração. Abaixo e acima da faixa de pH 5,0 a 7,5, o pigmento foi perdendo sua cor gradualmente. A estabilidade térmica foi estudada com extratos a pH 5, 6, 7 e 8, submetidos ao aquecimento nas temperaturas de 10, 30, 45 e 55ºC, por incubação das amostras em banho-maria, mantido por 6 dias, a cada temperatura específica. A estabilidade da PC também foi estudada a 4ºC. Os resultados mostraram que o efeito da temperatura sobre a estabilidade da PC indica que o pigmento é altamente instável a 45ºC e temperaturas acima desta. A PC perdeu a sua cor e os espectros realizados antes e após o tratamento a 50ºC mostraram o desaparecimento do pico de absorção a 615 nm. A partir da temperatura de 30ºC foi possível verificar ligeira perda de cor. Foi verificado que a PC mostrou-se bastante estável entre 4 a 10ºC, durante longos períodos (6 dias) (SARADA, PILLAI e RAVISHANKAR, 1999).
Um estudo avaliou o efeito da temperatura e do pH sobre a estabilidade de PC e determinou quais conservantes que são adequados para a manutenção da estabilidade da PC em preparações alimentícias. Para avaliar o efeito da temperatura, 30 mg de PC foi dissolvido em 30 mL de tampão citrato-fosfato, a pH 5,0; 6,0 e 7,0. As soluções foram incubadas com gradiente de doze temperaturas (26 a 74 ± 1ºC) por 30 min. Foi verificado que 47°C é a temperatura crítica para a estabilidade das soluções de PC estudadas, com uma queda acentuada nos valores de concentração e de meia-vida sendo detectados em temperaturas acima de 47ºC. Para melhor descrever o efeito do pH e da temperatura, soluções PC em cinco níveis de pH (pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 e 7,0 ± 0,1) foram incubadas a duas temperaturas diferentes (50ºC e 60ºC) usando a concentração de PC 1 mg/mL. Foram tomadas amostras para análise de 15 a 240 min. A solução de PC a pH 6,0 mostrou-se estável quando aquecida a 50ºC, enquanto que a solução em pH 5,5 foi estável a temperatura de 60ºC. Os autores também realizaram experimento simulando condição de pasteurização HTST (high temperature–short time) e mostraram que a concentração de PC permaneceu quase que inalterada, uma vez que a concentração de PC das soluções em pH 5,0; 6,0 e 7,0 foram na faixa de 96-100% do valor inicial, após tratamento a 74ºC durante 1 min (CHAIKLAHAN, CHIRASUWAN e BUNNAG, 2012).
Foi avaliado o efeito da temperatura na estabilidade de PC obtida de biomassa seca de Spirulina sp. Amostras do extrato purificado concentrado, contendo a PC, foram armazenadas a -20ºC e descongeladas antes da realização de cada experimento. Alíquotas de 100-200 µL de PC purificada foram incubadas em um termociclador de gradiente em diferentes temperaturas (50, 60, 70, 80 ± 1ºC) durante 30 min. As amostras também foram monitoradas a 25 ± 5ºC, deixando a proteína à temperatura ambiente durante 30 min. Outra experiência foi realizada em paralelo com alíquotas de 100-200 µL de PC purificada que foram incubadas no mesmo termociclador a uma temperatura fixa (80 ± 1ºC). Após 1, 3, 10, 30 e 60 min de incubação foram retiradas amostras para análise. O pH da solução foi ajustado para o
valor desejado (5,0; 7,0 ou 9,0) por meio de solução ácida ou básica de tampão fosfato 100 mM, para se avaliar a estabilidade térmica de PC purificada a diferentes valores de pH. A degradação térmica da PC foi monitorada seguindo o decaimento do pico de absorbância a 620 nm e foi definida a temperatura de fusão (Tm) de desnaturação. A Tm calculada para a PC purificada no extrato ajustado para pH de 7,0, foi de 57,5ºC. A PC mostrou ser mais estável a pH 5,0 (Tm calculada de 61,8ºC), enquanto que o pH 9,0 diminui fortemente a estabilidade da PC (Tm calculada de 49,9ºC). Com base nesses resultados, os autores adicionalmente avaliaram o efeito da ligação química cruzada no aumento da estabilidade da ficobiliproteína. Foram testados o efeito de frutose, sacarose, glicose, maltose, lactose e metilglioxal, mel convencional e mel de manuka (Leptospermum scoparium), no aumento da estabilidade da PC por ligarem-se quimicamente a fração proteica. Os resultados mostraram que o efeito conservante do açúcar, na manutenção da cor azul da ficocinanina, está relacionado com a concentração final do mesmo, ao invés do tipo de açúcar adicionado. Por esta razão, o melhor conservante foi a frutose, por apresentar maior solubilidade que os outros açúcares estudados na concentração de saturação (MARTELLI et al., 2014).
Nesse sentido, nosso grupo de pesquisa, intitulado “Aspectos Biotecnológicos do Cultivo de Microalgas e Cianobactérias” vem estudando as propriedades de ficobiliproteínas de diferentes cianobactérias, com a publicação do artigo descrevendo a estabilidade das ficobiliproteínas de Nostoc PCC 9205 em função de diferentes valores de pH de importância para o processamento e armazenamento de alimentos, sendo demonstrada maior estabilidade da fração vermelha (PE), em relação a fração azul (PC e APC) em função da diminuição do pH (MOREIRA et al., 2012). Considerando que os experimentos foram efetuados com extratos da biomassa de Nostoc PCC9205, e que nestes extratos, as proteínas de interesse estão presentes na forma de uma mistura complexa, condições que promovam a separação das frações vermelha e azul das ficobiliproteínas, contribuem para uma maior estabilidade dos pigmentos (MOREIRA, 2011). Além disso, técnicas como a microencapsulação (PASSOS, 2010) e a nanoencapsulação (PASSOS, 2014) da mistura de ficobiliproteínas, por promoverem a proteção física e química dos pigmentos hidrossolúveis, também representam estratégias para se promover o aumento da estabilidade das ficobiliproteínas de forma associada, para utilização em alimentos. Por outro lado, experimento desenvolvido pelo nosso grupo demonstrou que a estabilidade de ficobiliproteínas de Nostoc PCC9205 é função das condições de produção da biomassa e de extração das proteínas, e foi elucidado que a recuperação da biomassa por centrifugação promoveu a obtenção de extrato com maior relação ficoeritrina:proteína total, com maior estabilidade frente à redução do pH do extrato, quando comparada a recuperação da biomassa por filtração em papel (PEPE e RIZZO, 2011). Adicionalmente, é de interesse estabelecer as condições de cultivo que levem ao acúmulo de ficobiliproteínas na biomassa
de cianobactérias. Nesse contexto, no presente estudo foi utilizada a A. platensis que apresenta como ficobiliproteína de maior concentração a PC.