Pré-tratamento do capilar

A modificação na superfície interna do capilar possibilita uma melhor ligação do monolito com o capilar durante a etapa de polimerização, assegurando que o material resista às pressões elevadas durante o processo cromatográfico, sem ser expelido do

interior do capilar.

Sabendo que o pré-tratamento do capilar é uma etapa crítica no processo de preenchimento das colunas, além do pré-tratamento com NaOH 1,0 mol/L, avaliou-se o ancoramento usando trimetoxi(sililpropil)metacrilato.

A comparação das colunas obtidas a partir do preenchimento dos capilares com e sem ancoramento, com um mesmo sol, usando preenchimento por diferença de pressão (Figura 4), não evidenciou diferenças na ligação do monolito com o capilar, sendo que depois do lavado o monolito foi expulsou do capilar. Por isso optou-se em continuar o trabalho usando apenas o pré-tratamento com NaOH 1,0 mol/L. Na Figura 6 mostra-se as colunas monolíticas obtidas com os diferentes tratamentos dos capilares.

Figura 6. Fotomicrografias transversas dos monolitos baseados em TMOS. 1. Capilar vazio, 2. Capilar sem ancoramento, 3. Capilar com ancoramento utilizando trimetoxi(sililpropil)metacrilato.

4.1.2.2 Planejamento experimental fatorial fraccionado 25-1

Após a execução de todos os experimentos do planejamento experimental da Tabela 4 foi observado que a maioria das colunas ficaram vazias e algumas tinham monolitos de forma heterogênea ao longo do capilar, com partes bem preenchidas alternando com partes vazias.

Para estes experimentos, os capilares foram preenchidos usando bomba seringa e fechados com conectores de vidro. O fechamento dos capilares com conetores de vidro não foi eficiente pois deixaram vazar o sol antes de formar o gel, deixando os capilares quase vazios e inúteis para fazer a caracterização física e cromatográfica. As fotomicrografias dos capilares obtidos estão mostradas na Figura 7.

1

2

Figura 7. Fotomicrografias eletrônicas de varredura de uma das colunas monolíticas.

Entretanto, como os monolitos também foram preparados, em paralelo, em frascos, foi possível fazer a caracterização das suas estruturas. Nas fotomicrografias mostradas na Figura 8, feitas com os monolitos obtidos dos mesmos sols que foram preenchidos, observou-se que a grande maioria dos monolitos ficaram sem macroporos.

Figura 8. Fotomicrografias eletrônicas de varredura dos monolitos baseados em TMOS, sob diferentes condições de preparo, de acordo com a Tabela 4.

Uma explicação para isso seria a quantidade de PEG usada na mistura reacional, uma vez que a literatura descreve que maiores quantidades de PEG

C2 C7 C4 C8

C10 C13 C16

C1 C2 C3

diminuem o tamanho do macroporos, por isto decidiu-se testar quantidades menores nos próximos experimentos; além disso, a rampa do aumento da temperatura de gelificação até a temperatura de secagem pode ter sido muito brusca, proporcionando um colapso na estrutura do monolito.

A formação de macroporos é um processo competitivo entre a separação das fases e a transição sol-gel. Seu comportamento dinâmico é influenciado por fatores como massa molar e distribuição de macroporos nos oligômeros de sílica, a afinidade entre a mistura do solvente e os oligômeros, a proporção do desenvolvimento da rede gel, etc. Portanto a composição e a concentração de ácido e do PEG na solução inicial são parâmetros fundamentais que podem determinar a morfologia dos macroporos resultantes. Além disso, se recomenda que durante o processo de gelificação, a coluna deve ficar imóvel, qualquer movimento perto na transição sol-gel pode ser crítica (Miyazaki et al., 2011).

4.1.2.2.1 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho com refletância atenuada (IV-ATR)

A espectroscopia de absorção na região do infravermelho é uma ferramenta útil no monitoramento de reações de polimerização. Foram obtidos os espectros de todos os pontos do planejamento experimental. Como o material obtido dos frascos de reação não foram lavados para eliminar os resíduos das reações de polimerização, a interpretação dos espectros foi baseada na intensidade das bandas de absorção dos principais componentes da síntese.

Pode-se observar na Figura 9A que as amostras C2 e C4 apresentam um espectro IV similar, apesar da variação significativa de quantidade de PEG. Isto pode ser devido às altas quantidades de PEG usado. Como depois de certa quantidade de PEG a variação que é produzida na estrutura não é significativa, decidiu-se usar quantidades menores.

Na figura 9B os espectros C5 e C7 são similares, o que os difere na síntese foi também a quantidade de PEG empregada. No C5 foi usado 1000 mg e no C7, 2000 mg. Para a amostra C8 obteve-se uma diferença no espectro na qual a intensidade da banda em 2900 cm-1_{(atribuída ao estiramento assimétrico C-H) é diminuida com o}

aumento na quantidade de TMOS (500 µL para C5 e C7 e 4000 µL para C8). Como a análise foi feita em relação aos resíduos da reação, uma diminuição na banda principal

do espectro indica uma maior reação do precursor TMOS.

Figura 9. Espectros no IV dos monolitos baseados em sílica preparados de acordo com a Tabela 4.

Nos espectros de IV dos monolitos baseados em sílicas, foram identificadas as principais bandas na faixa de número de onda entre 4000 e 400 cm-1_:

• 2900, atribuída ao estiramento assimétrico C-H de carbono sp3_;

• 2860, de fraca intensidade, atribuída ao estiramento simétrico C-H de carbono sp3_;

• 2357, pouco intensa, cuja atribuição não foi encontrada na literatura; • 1728, de forte intensidade, correspondente ao estiramento C=O de éster; • 1466 e 1457, atribuídas à deformação C-H de carbono sp2_;

400 1400 2400 3400 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 C2.spc C4.spc Comprimento de onda [nm] T ra n s m it â n c ia 400 1400 2400 3400 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 C5.spc C7.spc C8.spc Comprimento de onda [nm] T ra n s m it â n c ia A B

• 1389, pouco intensa e atribuída à deformação C-H de carbono sp3_; • 1151, de média intensidade, atribuída ao estiramento C-O de éster.

4.1.2.3 Planejamento experimental fatorial completo 23

Para este planejamento foram feitas mudanças nas condições experimentais, levando em consideração os resultados obtidos no primeiro planejamento. Neste conjunto de experimentos, as misturas foram injetadas nos capilares com um sistema de fluxo de N2, que permite um preenchimento em segundos, muito mais rápido e

uniforme, evitando possíveis pulsações que ocorrem com a bomba seringa.

Tentando diminuir o vazamento que se observou nas colunas preparadas anteriormente com os conectores de vidro, decidiu-se fechar as colunas com borrachas, depois de preenchidas e durante todo o tratamento térmico.

A etapa mais crítica na síntese do monolito é a evaporação do solvente do gel. O grande estresse gerado no mesoporo pode exceder a força da rede e causar formação de rupturas e encolhimento por destruição da rede (Rieux et al., 2005). Para a primeira fase de aquecimento ou etapa de gelificação usou-se 43 °C. Com temperaturas menores de 40 °C as reações de hidrólises e poli condensação são muito mais lentas. Por outro lado, uma elevada temperatura causa uma cinética muito rápida da reação de condensação e um menor tempo disponível para a rede no gel (Planeta et al., 2010).

Para a segunda etapa de secagem, após formado o gel, a temperatura foi aumentada gradual e lentamente para evitar que mudanças bruscas na temperatura pudessem quebrar o monolito ou encolhê-lo. O aumento da temperatura de gelificação até a temperatura de secagem foi feito mediante uma rampa de aquecimento (43 °C; 10 °C/30 min até a temperatura de 100 °C ou 120 °C) procurando obter menor encolhimento.

Para a temperatura final de secagem usou-se uma temperatura de 100 °C ou 120 °C, uma vez que com 80 °C não se obteve uma secagem completa do gel quando aplicada em tempos menores.

Como o parâmetro tempo de secagem não mostrou alteração significativa no primeiro planejamento usando tanto 6 h como 12 h, decidiu-se deixa-lo fixo por 6 h, levando em conta que esta etapa só é requerida para a eliminação do solvente residual no gel e após este período observou-se sua eliminação total.

A uréia foi escolhida como catalisador para os próximos experimentos, uma vez que não altera o pH da solução inicial permitindo a hidrólise do agente precursor e a polimerização da reação. Além disso, é muito usado como aditivo químico para controle de secagem (DCCA), do inglês Drying Control Chemical Additive, já que permite controlar o tamanho dos mesoporos e macroporos durante a etapa de secagem e que pode auxiliar na redução das tensões durante a etapa de secagem através da redução das taxas de evaporação. DCCA básicos como a uréia que liberam amônia mediante um aumento de temperatura, produzem uma grande rede sol-gel com grandes poros uniformes. Por outro lado, um DCCA ácido, como ácido oxálico ou ácido acético, produz uma rede menor após a gelificação, com uma estreita distribuição de poros (Schneider Jr, 1991).

Na Figura 10 pode-se observar que as colunas D3, D5 e D7 se mostraram heterogêneas em relação à seção transversal. O monolito se acumulou na parte de baixo, ficando a parte de cima vazia. A tendência da separação das fases é determinada principalmente pela razão PEG/sílica ou a um encolhimento sofrido por uma razão do aumento de temperatura de secagem brusca.

Figura 10. Fotomicrografias transversas dos monolitos baseados em TMOS, sob diferentes condições de preparo, de acordo com a Tabela 6.

A Figura 11 mostra as fotomicrografias dos monolitos obtidos com o planejamento experimental 23_{. A fase D2 apresentado boa homogeneidade, sendo}

possível verificar a formação dos macroporos (canais), além do esqueleto contínuo. D1 D6 D2 D4 D8 D3 D5 _D7

Figura 11. Fotomicrografias eletrônicas de varredura dos monolitos baseados em TMOS, sob diferentes condições de preparo, de acordo com a Tabela 6. Aumentos de 250 vezes e 5000 vezes. D1 D2 D4 D3 D5 D6 D7 _D8

4.1.2.3.1 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho com refletância atenuada (IV-ATR)

O material sintetizado também foi caracterizado por infravermelho. As amostras de sílica monolítica preparadas no bequer foram lavadas exaustivamente com água e etanol, usando ultrassom por 30 min para cada solvente, para retirar os resíduos da etapa de síntese. A seguir foram secos no forno a 120 °C por 12 h. A Figura 12 mostra o espectro IV do monolito de sílica. O espectro possui bandas características de polímeros baseados em sílica. As bandas na região de 1000-1200 cm-1 _{e a banda em}

torno de 800 cm-1 _{são características das vibrações das ligações Si-O-Si. Embora as}

bandas em torno de 1000 cm-1 _{se sobrepõem às bandas das ligações Si-OH, é}

possível observar as variações da forma das bandas (Hara, 2013).

Figura 12. Espectro IV do monolito de sílica obtido baixo as condições do experimento D2.

4.1.2.4 Otimização da quantidade de uréia e PEG

Um novo estudo foi feito deixando as colunas fixas verticalmente durante o processo de gelificação e polimerização para observar se os encolhimentos foram causados por gravidade. Neste estudo foi usada uma rampa de aquecimento mais suave de 43 °C; 5 °C/30 min até 120 °C.

A quantidade de TMOS escolhida foi o nível superior (4000 µL), tendo em considerações resultantes do experimentos que apresentaram menos encolhimento. As proporções da quantidade de PEG:uréia 1:2, 2:1 e 1:1 foram usadas para

400 1400 2400 3400 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 D2.spc Comprimento de onda [nm] T ra n s m it â n c ia

avaliar a influência de diferentes concentrações de uréia na estrutura monolítica.

Na Figura 13, se observam menos encolhimento, colunas melhores preenchidas e mais uniformes.

Figura 13. Fotomicrografias eletrônicas de varredura dos monolitos baseados em TMOS, sob diferentes condições de preparo, de acordo com a Tabela 7. Aumento 250 vezes.

E1 E2

E3 _E4

No sistema sol-gel foi usado um precursor hidrofílico (TMOS). Devido à reações de hidrólise e de condensação, a energia livre de Gibbs do sistema é aumentada e induzida à decomposição espinoidal e, em seguida, a separação de fase, caracterizado por estruturas contínuas e dinâmicas sendo formadas relativamente lentas. Começa com uma flutuação infinitesimal da composição incrementando em amplitude e contraste entre as fases; uma rica em sílica (esqueleto) e outra rica em solvente (macroporos).

Assim, a variação do tamanho do esqueleto e de poros ao variar a quantidade de PEG pode ser explicada por um mecanismo de separação de fases. Portanto, a velocidade de separação de fases e a velocidade de transição sol-gel são responsáveis pela morfologia do monolito final. O aumento na quantidade de PEG reduz a energia livre de Gibbs, resultando em uma separação de fases relativamente lenta (Azzouz et al., 2015).

Finalmente, quando o TMOS e a quantidade de ácido acético foram mantidas constantes, um aumento na quantidade de PEG causou diminuição no tamanho do esqueleto e tamanho de poros através do monolito de sílica.

Na Figura 14, é possível verificar os diferentes tamanhos de esqueleto obtidos com diferentes quantidades de PEG. Nas figuras E3, E4 e E5 se tem esqueletos maiores para valores de PEG menores e uma diminuição do esqueleto para as colunas obtidas com quantidades de PEG maiores.

Inicialmente se tinha que a etapa mais crítica na síntese do monolito seria a evaporação do solvente do gel. Portanto, para a segunda etapa de aquecimento, a etapa de secagem, a temperatura foi aumentada gradual e lentamente para evitar que mudanças bruscas na temperatura pudessem quebrar o monolito ou encolhê-lo.

De acordo com as observações, depois de diminuir a velocidade de aquecimento, a etapa de secagem não foi uma parte crítica do processo de preparação e todos os espaços vazios foram desenvolvidos no gel depois da etapa de gelificação.

É por isso que depois de definir uma rampa de temperatura muito lenta (desde

43 °C; 5 °C/30 min até 120 °C e mantida por 2 h) e ainda assim obter certo encolhimento, decidiu-se diminuir a temperatura de gelificação para 40 °C, uma vez que terminada esta etapa alguns géis já tinham começado o encolhimento. As rupturas no interior das colunas desapareceram e colunas homogêneas e totalmente preenchidas foram obtidas.

Figura 14. Fotomicrografias eletrônicas de varredura dos monolitos baseados em TMOS, sob diferentes condições de preparo, de acordo com a Tabela 7. Aumento 5000 vezes.

A adição da uréia afetou fortemente a estrutura do monolito de sílica obtido, como pode ser visto pela forma do esqueleto do monolito. Assim, foram obtidas partículas esféricas distorcidas e o crescimento dos glóbulos foi suprimido pelo aumento na quantidade da uréia.

A Figura 14 mostra a variação no crescimento dos glóbulos com o aumento da E1

E5

E2

E3 E4

uréia. A maior quantidade de uréia adicionada à mistura inicial suprimiu o crescimento obtendo as estruturas monolíticas E1 e E6 com maior porosidade.

A adição da uréia não alterou significativamente o pH da mistura inicial. Foram feitas leituras do pH da mistura inicial sem precursor com diferentes quantidades de uréia e, devido ao ácido ácetico, a solução ficou tamponada porque não houveram diferenças significativas do pH com as diferentes quantidades de uréia.

4.1.2.4.1 Análise termogravimétrica

A estabilidade térmica do monolito baseado em sílica preparado no bequer foi avaliada por termogravimetria e o resultado está mostrado na Figura 15.

0 200 400 600 800 1000 70 75 80 85 90 95 100 105 % (m/m) Derivada (%/°C) Temperatura (°C) % ( m /m ) -0,05 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 D e riv a d a ( % /° C )

Figura 15. Curvas de TGA e DTG obtidas para o monolito sílica E6.

As curvas mostram que não há degradação do material monolítico até aproximadamente 195 °C, quando se inicia a perda de massa do material, mostrando que a fase estacionária é termicamente estável até esta temperatura. A perda total da massa da amostra se deu na temperatura aproximada de 400 °C. A porcentagem de massa perdida deve-se principalmente aos grupos funcionais OH presentes na superfície da estrutura que são eliminados com aumentos de temperaturas maiores.

4.1.2.4.2 Área superficial

A área superficial do monolito baseado em sílica (E6) foi avaliada por sorção de nitrogênio e se mostrou igual a 461 m2_{/g, indicando possbilidade de interação entre}

o analito e fase estacionária.

Os altos valores de área superficial correspondem a materiais ricos em microporos, pois quanto maior o número de microporos em um sólido poroso, maior sua área superficial.

Normalmente as propriedades porosimétricas dos monolitos são avaliadas por meio de técnicas de sorção de nitrogênio no interior da coluna capilar, enquanto que a medida realizada no presente trabalho foi obtida a partir do monolito não confinado no interior do capilar, ou seja, a partir do béquer.

Além disso, o método de preparo, bem como a proporção dos reagentes utilizados, podem levar a alterações nas características dos materiais monolíticos, incluindo a área superficial, o que pode limitar comparações entre resultados para o material obtido e o relatado na literatura.

4.2 Caracterização cromatográfica das fases estacionárias

A macroporosidade dos monolitos permite o fluxo da fase móvel através da rede tridimensional, enquanto que a micro porosidade contribui para um aumento na área de superfície do monolito e, por conseguinte, uma transferência de massa mais rápida de solutos entre a fase estacionária e móvel, melhorando a retenção seletivo cromatográfica de compostos a serem separados (Azzouz et al., 2015).

Um cromatograma obtido para o capilar preenchido com sílica monolítica é mostrado na Figura 16. Pode-se notar que a retenção ocorreu no modo HILIC, pois a ordem de eluição dos compostos mostra um caráter polar da fase estacionária sendo que os compostos mais apolares eluíram primeiro e os mais retidos foram a cafeína e a uracila.

Figura 16. Cromatograma da separação de mistura teste em colunas monolíticas baseadas em sílica D2. Condições cromatográficas: fase móvel-ACN:H2O 80:20 (%v/v); Vazão-2 µL/ min; temperatura do forno da coluna-30 °C; volume de injeção-50 nL. Analitos: (1) naftaleno, (2) tolueno, (3) cafeína, (4) benzonitrila, (5) uracila. Concentração do analito 500 µg/mL Detecção UV em 254 nm.

A Tabela 9 mostra as eficiências cromatográficas obtidas para a coluna monolítica D2, onde se tem para o analito mais retido uma eficiência cromatográfica de 11700 pratos/m.

Tabela 9. Parâmetros cromatográficos da fase estacionária monolítica baseada em sílica (D2). Analitos Eficiência cromatográfica (pratos/m)a Fator de retenção (k) Resolução (Rs) Naftaleno 517 -- -- Tolueno 1073 0,5 1,1 Cafeína 1508 0,8 0,6 Benzonitrila 5361 1,9 2,2 Uracila 11700 2,8 1,4 a _{Comprimento da coluna: 13 cm} 0 7 14 21 0 60 120 S in a l, m A U

4.3 Avaliação da reprodutibilidade na síntese do monolito de sílica

Os monolitos são conhecidos por ter dificuldades em sua repetibilidade. Após a otimização das condições de síntese do preparo dos monolitos baseados em sílica, fez-se um novo preparo com as melhores condições e comparou-se as estruturas monolíticas com as anteriormente obtidas nas mesmas condições de preparo.

As estruturas monolíticas de sílica mostradas na Figura 17 mostram que o processo sol-gel otimizado permite ter estruturas monolíticas homogêneas e colunas bem preenchidas. Comparando as estruturas monolíticas preparadas E4-E4b e E6- E6b, o material monolítico apresentou tamanho regular, com domínios de tamanho uniforme.

Figura 17. Fotomicrografias dos monolitos baseados em sílica sintetizados em duplicata. Aumento 5000 vezes.

Finalmente, a fim de observar os efeitos das quantidades de uréia no preparo do monolito, foi feito o experimento F1 com as mesmas condições de preparo do monolito E6b, variando só a proporção de uréia sendo 1:1 para F1 e 1:2 para E4b. A

E4 E4b

Figura 18 mostra que a maior quantidade de uréia usada em E4b diminuiu o tamanho dos glóbulos resultando em uma estrutura de baixa permeabilidade e maior pressão observada durante a lavagem dos resíduos na bomba cromatográfica.

Figura 18. Fotomicrografias eletrônicas de varredura dos monolitos baseados em TMOS, sob diferentes condições de preparo, de acordo com a Tabela 8. Aumento 250 vezes e 5000 vezes. E4b E4b F1 E6b E6b F1