Preparação dos vasos contendo mudas de Brachiaria decumbens

Foram utilizados vasos plásticos com dimensões de 25 cm de altura e 26 cm de diâmetro para o plantio das mudas de Brachiaria decumbens. Os vasos foram preenchidos com 20 kg de solo proveniente de áreas de pastagem da fazenda experimental da Embrapa Gado de Leite, localizada no município de Coronel Pacheco, MG (Figura 1A), sem prévia esterilização, visando

manter as condições mais próximas do ambiente natural. Em seguida, aproximadamente seis mudas de B. decumbens foram adicionadas em cada vaso (Figura 1B).

Figura 1. A: Vaso preenchido com 20 kg de solo proveniente de áreas de pastagem da fazenda experimental da Embrapa Gado de Leite, localizada no município de Coronel Pacheco, MG. B: Plantio das mudas de Brachiaria decumbens. C: Vasos com fita adesiva nas bordas, mantidos em área com incidência direta de sol e chuva nas instalações externas do Laboratório Avançado de Zoologia da Universidade Federal de Juiz de Fora, localizada no município de Juiz de Fora.

Todos os vasos foram mantidos em área com incidência direta de sol e chuva nas instalações externas do Laboratório Avançado de Zoologia da Universidade Federal de Juiz de Fora, localizada no município de Juiz de Fora (Figura 1C). Os vasos foram molhados diariamente

por todo período anterior ao início do experimento, sendo feita também adubação com uréia para acelerar o crescimento das mudas. No entanto, 30 dias antes do início do experimento, as adubações com ureia foram interrompidas para evitar resíduos desse composto que é tóxico para R. microplus (CUNHA et al., 2008). Também foram feitas podas eventuais para manutenção da gramínea apenas na parte central dos vasos e com altura de 40 cm.

2.5 Experimento

A preparação e manutenção dos vasos foram feitas durante os meses de maio a julho e a aplicação dos tratamentos foi feita no início do mês de agosto, do mesmo ano. Todo o experimento foi realizado em 72 horas. No primeiro dia uma fita adesiva foi colada nas bordas dos vasos para impedir a fuga das larvas (Figura 1C). Logo depois foi feita a deposição das larvas na base das mudas de B. decumbens em 40 vasos plásticos. Em cada vaso foram depositadas larvas provenientes de 100 mg de ovos previamente acondicionados no interior de uma seringa (Figura 2A).

Após 24 horas, foi feita a observação da migração das larvas para o ápice das folhas de B. decumbens em todos os vasos (Figura 2B) e, em seguida, foi feita a aplicação do timol nas diferentes concentrações testadas. Para cada concentração (tratamento) foram escolhidos cinco vasos aleatoriamente, e com a utilização de pulverizador manual foi feita a aplicação de aproximadamente 25 mL da solução em cada vaso (Figura 2C). A aplicação foi concentrada na parte superior das plantas, onde as larvas estavam aglomeradas. Para evitar a contaminação de outros vasos, no momento da pulverização, cada vaso foi levado para uma área isolada, onde foi feita a aplicação e identificação do vaso (com fita adesiva) de acordo com o tratamento. Após essa etapa, os vasos de cada tratamento foram enfileirados na parte externa do Laboratório Avançado de Zoologia da Universidade Federal de Juiz de Fora, com 50 cm de distância entre cada fileira (Figura 3). A aplicação também foi feita sempre pela mesma pessoa para evitar qualquer interferência na forma de aplicação.

Também foi formado um grupo controle com aplicação de etanol 50º GL, solvente que possui baixa toxicidade para larvas de R. microplus (CHAGAS et al., 2003; GONÇALVES et al., 2007). Devido à volatilidade do timol, os vasos referentes ao grupo controle foram mantidos afastados dos vasos dos grupos tratados.

Figura 2. A: Larvas de Rhipicephalus microplus sendo depositadas na base das mudas de Brachiaria decumbens. B: Migração das larvas para o ápice das folhas de B. decumbens. C: Aplicação do timol nas diferentes concentrações testadas com pulverizador manual.

Figura 3. Vasos contendo larvas de Rhipicephalus microplus distribuídos em fileiras, cada uma correspondente a um tratamento com determinada concentração de timol. Os vasos foram mantidos em área aberta com incidência direta de sol e chuva.

A avaliação da sobrevivência das larvas foi feita 24 horas após a aplicação das soluções. Cada vaso foi analisado individualmente e os filetes de capim que continham larvas foram cortados com tesoura, acondicionados em placas de Petri (Figura 4A e B) e levados para o laboratório para a realização da contagem das larvas vivas. As larvas foram contabilizadas com utilização de bomba a vácuo acoplada em uma mangueira de borracha com uma ponteira adaptada na extremidade que foi utilizada para sucção de cada larva viva encontrada (Figura 4C). Foram consideradas mortas as larvas que permaneceram imóveis e não responderam a estímulos como exposição ao gás carbônico. Foi feita a comparação entre o número médio de larvas vivas encontrado no grupo controle com número de larvas encontrado em cada tratamento. A eficácia do tratamento foi obtida pela seguinte fórmula: % eficácia = (A-B x 100)/A, segundo BITTENCOURT et al. (2003).

Sendo, A = média de larvas vivas no grupo controle e B = média de larvas vivas no grupo tratado.

Figura 4. A: Corte dos filetes de capim contendo larvas de Rhipicephalus microplus. B: Filetes de capim contendo as larvas. C: Contagem das larvas vivas por meio de sucção

utilizando uma bomba a vácuo acoplada em uma mangueira de borracha com uma ponteira adaptada na extremidade.

2.6 Análise dos dados

Para realização da análise estatística do número médio de larvas vivas em cada tratamento foi utilizado o teste não paramétrico Kruskal-Wallis através do software Biostat versão 5.0.

As Concentrações Letais de 50 e 90% (CL50 e CL90) e seus respectivos Intervalos de Confiança (IC 95%) foram calculados pela análise de Probit (FINNEY, 1971), utilizando o programa POLOPC® (LeOra Software, 1987, Berkeley, CA, USA).

3 RESULTADOS

Os resultados do estudo estão apresentados na Tabela 1. Nos tratamentos com as maiores concentrações de timol (10, 15, 20, 25 e 30,0 mg/mL) foi observado em média, menos de 50 larvas vivas por tratamento, diferindo significativamente (p<0,05) no número de larvas vivas do grupo controle (em média 1.079) (Tabela 1) (Figura 5A e B). Nos tratamentos com as concentrações de 2,5 e 5,0 mg/mL, o número médio de larvas vivas foi de 631 e 483, sendo estatisticamente similar ao controle (p>0,05).

Tabela 1 – Número médio de larvas vivas de Rhipicephalus microplus recuperadas de vasos tratados com timol em diferentes concentrações e percentual de eficácia dos tratamentos. (média ± desvio padrão).

Tratamentos Número médio de larvas vivas ± Desvio padrão

Eficácia dos tratamentos (%)

Controle (Etanol 50ºGL) 1079,6a±514,35 Timol 2,5 mg/mL 631,6a±229,36 41,49 Timol 5,0 mg/mL 483,4a±133,78 55,22 Timol 10,0 mg/mL 41,0b±15,06 96,20 Timol 15,0 mg/mL 49,6b ±39,51 95,40 Timol 20,0 mg/mL Timol 25,0 mg/mL Timol 30,0 mg/mL 1,4bc±0,89 0,2c±0,44 0,2c±0,44 99,87 99,98 99,98

Médias seguidas de letras diferentes nas colunas diferem entre si em nível de significância de 5%. Nas menores concentrações testadas (2,5 e 5,0 mg/mL) a eficácia dos tratamentos foi de 41,49% e 55,22%, respectivamente. Nos demais tratamentos a eficácia foi superior a 90%, chegando a 99% nos tratamentos com as concentrações de 20,0, 25,0 e 30,0 mg/mL de timol (Tabela 1). As CL50 e CL90 da eficácia dos tratamentos foi de 3,45 e 9,25 mg/mL respectivamente (Tabela 2).

Tabela 2 – CL50 e CL90 do timol sobre larvas não ingurgitadas de Rhipicephalus microplus mantidas em condições semi-naturais.

CL50 (mg/mL) IC (95%) CL90 (mg/mL) IC (95%)

3,45 2,89-4,11 9,25 7,71 - 13,16

Figura 5. A: Larvas de Rhipicephalus microplus do grupo tratado, mortas e ainda aderidas à forrageira; B: Larvas de R. microplus do grupo controle, vivas, aglomeradas e caminhando sobre a forrageira.

4 DISCUSSÃO

Os óleos essenciais e seus constituintes são alternativas promissoras ao uso de compostos químicos sintéticos no controle de pragas, visando diminuir os efeitos negativos dos pesticidas sintéticos (BAKKALI et al., 2008). O timol, monoterpeno encontrado no óleo essencial de plantas das famílias Lamiaceae e Verbenaceae (PENGELLY, 2004) já teve sua atividade carrapaticida comprovada em trabalhos in vitro sobre larvas (NOVELINO et al., 2007; SCORALIK et al., 2012) e fêmeas (MONTEIRO et al., 2010) de R. microplus. Contudo, ainda não existem trabalhos sobre a aplicação do timol no ambiente para o controle de carrapatos, sendo o presente estudo o primeiro a avaliar a atividade do timol sobre larvas de R. microplus em condições semi-naturais.

No presente estudo foi observado mortalidade acima de 90% das larvas de R. microplus a partir da concentração de 10 mg/mL de timol, enquanto no trabalho desenvolvido por SCORALIK et al. (2012) in vitro, foi observado o mesmo percentual de mortalidade a partir da concentração de 2,5 mg/mL. Diferenças também foram observadas com relação aos valores de CL50, uma vez que no estudo in vitro realizado por ARAÚJO et al. (2014) a CL50 observada foi de 1,53 mg/mL, enquanto no presente estudo foi observado valor de 3,45 mg/mL. Tais diferenças podem estar relacionadas ao tipo de metodologia e à maior dissipação do timol em ambientes abertos. Nos trabalhos de SCORALIK et al. (2012) e ARAÚJO et al. (2014) os experimentos foram desenvolvidos em condições controladas em laboratório utilizando o método de pacote de larvas adaptado por MONTEIRO et al. (2012), metodologia que garante o contato contínuo de todas as larvas com o princípio ativo testado e os grupos experimentais foram mantidos em câmara climatizada, diferindo das condições do presente estudo.

Apesar de ainda não existirem estudos sobre a aplicação do timol no ambiente para o controle de carrapatos, estudos com essa abordagem já foram feitos com o carvacrol, monoterpeno isômero do timol que também é muito comum em óleos essenciais de plantas do gênero Lippia (BOTELHO et al., 2007; CAVALCANTI et al., 2010), sendo obtidos resultados satisfatórios. DOLAN et al. (2009) verificaram percentual de controle de 100% para ninfas de Ixodes scapularis Say, 1821 (Acari: Ixodidae) e Amblyomma americanum (Linnaeus, 1758) (Acari: Ixodidae) um dia após a aplicação do carvacrol na concentração de 5,0% com utilização

de um pulverizador costal em camada de serapilheira infestada por esses carrapatos. Sete dias após o tratamento, os valores para o percentual de controle para I. scapularis e A. americanum decaíram para 82,7 e 65,6%, respectivamente. Em outro estudo, JORDAN et al. (2011) observaram uma rápida diminuição da população de ninfas de Ixodes scapularis e Amblyomma americanum quando utilizaram o carvacrol na concentração de 2% em ambiente natural de pastagem, ocorrendo mortalidade acima de 90% das ninfas um dia após o tratamento. No entanto, quatorze dias após o tratamento, a taxa de mortalidade decaiu para 76,7%, sendo necessária uma nova aplicação do produto.

Embora não se tenha estudos com carrapatos, cabe ressaltar que a aplicação do timol no ambiente para o controle de pragas já foi investigada sobre outros organismos. Em pesquisa desenvolvida por JI et al. (2005) visando controlar a bactéria Ralstonia solanacearum em plantações de tomate, os autores relataram que o timol, na concentração de 0,7% reduziu o percentual de plantas infectadas por essa bactéria (12%), enquanto no grupo controle (tratado com o solvente, etanol 70%) esse percentual foi de 65,5%. Além disso, foi observado maior produtividade de tomates nas parcelas tratadas, uma vez que ocorreu aumento do número e tamanho dos frutos produzidos. Produtos à base de timol também são utilizados com alto percentual de eficácia para o controle do ácaro Varroa destructor Anderson & Trueman, 2000, parasito de abelhas Apis mellifera Linnaeus, 1758 (BAGGIO et al., 2004) e praga de apiários. CASTAGNINO & ORSI (2012) ao avaliar os efeitos do timol isolado sobre V. destructor em colônias de abelhas A. mellifera africanizadas, observaram que essa substância foi capaz de reduzir a infestação em 67,1%.

Em outros países foram observados bons resultados em estudos que realizaram a aplicação de carrapaticidas sintéticos no ambiente visando controlar a infestação por diferentes espécies de carrapatos (LABRUNA, 2008). MOUNT et al. (1999) avaliaram a aplicação de agroquímicos em ambientes não agrícolas para o controle do carrapato Amblyomma americanum (Linnaeus). Esse método resultou na redução de 81, 76 e 68% da população de larvas, ninfas e adultos, respectivamente. Quando empregado de maneira integrada com a capina da vegetação, a redução foi de 95, 92 e 87% para larvas, ninfas e adultos. No entanto, a aplicação de agroquímicos no ambiente tem como aspecto desfavorável o risco de contaminação ambiental, fato que pode ser minimizado com a utilização do timol.

MIÑAMBRES et al. (2010) avaliaram “in vitro” o impacto de diferentes dosagens de timol sobre comunidades microbianas que ocorrem no solo, quando aplicado isoladamente ou em combinação com um fungicida e observaram que a aplicação de timol não alterou significativamente a atividade microbiana e a biomassa de fungos presentes no solo, podendo apenas representar um risco para diminuição das bactérias gram-negativas. Contudo, a aplicação do fungicida no solo causou a diminuição na atividade microbiana e na biomassa de fungos de forma mais acentuadamente que o timol. E ainda nesse estudo, foi possível observar que quando foi feita a aplicação do fungicida em mistura com o timol, esses efeitos negativos foram minimizados.

Nos Estados Unidos, a Agência de Proteção Ambiental (EPA) reconhece o timol como um composto seguro devido à sua origem vegetal, considerando que sua utilização em pesticidas registrados não resultará em efeitos adversos para o meio ambiente e para a saúde humana (ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY- UNITED STATES, 1993). HU & COATS (2008) demonstraram que o timol é rapidamente dissipado tanto na água quanto no solo em condições aeróbicas. Esses autores avaliaram o tempo de dissipação de 50% (TD50) do timol nesses dois ambientes e observaram que na água, a TD50 foi de 16 dias e no solo, de apenas 5 dias, sendo a volatilização a principal via de dissipação.

Segundo ISMAN et al. (2011), com raras exceções, os óleos essenciais e seus principais constituintes são relativamente não tóxicos para mamíferos, apresentando valores de DL50 oral aguda em roedores entre 800 a 3.000 mg kg-1 para compostos puros e 5.000 mg kg-1 para produtos formulados. Além disso, devido à sua volatilidade, em geral os óleos e os seus constituintes são ambientalmente não persistentes.

No presente estudo, a aplicação do timol foi feita apenas na parte distal das folhas da forrageira. A aplicação do timol apenas na camada mais elevada da vegetação também pode representar uma alternativa para minimizar ainda mais a possibilidade de impactos ambientais. Nesse contexto, a aplicação nessa camada da vegetação seria direcionada ao combate de larvas infestantes que devido ao comportamento de subir até o ápice do capim, acabariam entrando em contato com a substância. Com relação aos impactos ambientais, esse tipo de aplicação apresenta como aspecto favorável a possibilidade de utilização de menores concentrações, uma vez que as larvas são o estágio mais sensível ao timol (MONTEIRO et al., 2010; SCORALICK et al., 2012), além de evitar que essa substância entre em contato e ocasione algum tipo de interferência em

organismos benéficos que se encontram na base da vegetação e no solo. Esse tipo de aplicação também pode causar diminuição da infestação dos bovinos devido à alteração no comportamento das larvas, uma vez que teste in vitro demonstrou que timol também apresenta atividade repelente sobre esse estágio de R. microplus (NOVELINO et al., 2007). Assim, a aplicação no ápice da vegetação pode matar as larvas que estão no ápice (fato reproduzido no presente estudo) e repelir as que estão na base da vegetação (possibilidade que merece ser investigada em condições naturais), evitando que essas se desloquem até a parte superior do capim e entrem em contato com o hospedeiro.

A partir dos resultados obtidos no presente estudo, conclui-se que o timol quando aplicado em pastagem de B. decumbens sob condições semi-naturais, em concentrações a partir 10 mg/mL é eficaz sobre larvas de R. microplus, reduzindo significativamente o número de larvas infestantes. Esses resultados ainda reforçam o potencial da utilização do timol como alternativa aos carrapaticidas químicos sintéticos no controle desse ixodídeo. Entretanto, ainda se faz necessário o desenvolvimento de estudos em ambientes naturais, além da avaliação do efeito dessa substância sobre organismos não-alvo, inseridos dentro do ambiente de pastagem.

5 CONCLUSÕES GERAIS