Preparações de átrio isolado de rato - Ensaios farmacológicos in vitro

4.2 Ensaios farmacológicos in vitro

4.2.1 Preparações de átrio isolado de rato

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Os valores de PA e FC foram registrados 24h após o procedimento cirúrgico pela conexão do cateter arterial a um transdutor de pressão pré-calibrado (Statham P23 ID; Gould, Cleveland, OH, EUA) e conectado a um micro-computador equipado com placa conversora analógico-digital (CIO-DAS16/JR, Computers Boards, Inc., Mansfield, MA, EUA) e com o programa CVMS (WPI. Sarasota, FL, EUA) (Figura 4). A frequência escolhida para amostragem dos dados foi de 500 Hz. Para cada ciclo cardíaco, o computador calculava pressão arterial sistólica, diastólica e média, e o intervalo de pulso. O cateter venoso foi implantado para a administração das drogas.

Figura 4 – Aparato utilizado para o registro dos valores de PAM e FC em ratos normotensos e hipertensos

4.2 Ensaios farmacológicos in vitro

4.2.1 Preparações de átrio isolado de rato

Os átrios foram isolados de acordo com a técnica descrita por Nasa et al. (1992). Os ratos foram eutanasiados e em seguida, os átrios esquerdo e direito foram retirados perpendicularmente ao eixo do coração, suspensos por fios de

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algodão e mantidos em cubas de 10 mL contendo solução de Krebs-bicarbonato a 37 oC e gaseificados com carbogênio. Cada átrio foi mantido a uma tensão inicial de 0,5 g por 60 minutos. Durante este tempo de estabilização, o meio nutritivo foi trocado a cada 15 minutos.

Como o átrio esquerdo não apresenta o nodo sino-atrial, ele foi estimulado eletricamente através de eletrodos de platina, por pulsos retangulares com uma frequência de 3 Hz, duração de 3 ms e uma voltagem de 1,5 vezes o limiar de excitação. Os parâmetros cardíacos foram captados pelo sistema de aquisição AQCAD (versão 2.3.3.0; AVS Projetos, Brasil) (Figura 5).

O efeito inotrópico foi calculado a partir da amplitude de contração do átrio esquerdo antes (controle) e após a administração de IM-7. O efeito cronotrópico foi avaliado no átrio direito, por conter o nodo sino atrial. A frequência controle (batimentos/min) foi registrada no início do experimento e considerada como 100% .

Figura 5 - Sistema de cubas para órgão isolado utilizado para a realização de protocolos com átrio

isolado de ratos

4.2.2 Preparações dos anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato

Os ratos foram eutanasiados e através de uma incisão no abdome do animal, foi retirada a artéria mesentérica superior. Anéis do primeiro seguimento da

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artéria (1-2 mm) foram obtidos livres de tecido conectivo e adiposo e mantidos em cubas de 10 mL contendo solução de Tyrode, a 37 oC e gaseificada com uma mistura de 95% de O2 e 5% de CO2 (carbogênio). Os anéis foram suspensos por linhas de algodão e fixadas a um transdutor de força, acoplado a um sistema de aquisição (Miobath-4, WPI, Sarasota, EUA) para o registro das tensões isométricas (Figura 6). Cada anel foi submetido a uma tensão constante de 0,75 g por um período de estabilização de 60 minutos. Durante esse tempo o meio nutritivo foi trocado a cada 15 minutos para prevenir a interferência de metabólitos (ALTURA; ALTURA, 1970).

Figura 6 – Sistema de cubas e aquisição de dados de tensão isométrica para órgão isolado utilizado para a realização dos protocolos com artéria mesentérica superior isolada de rato

4.3 Protocolos experimentais desenvolvidos com ratos normotensos

Os experimentos realizados em animais normotensos com IM-7 tiveram como objetivo complementar os resultados anteriores obtidos com este composto e esclarecer melhor os efeitos cardiovasculares deste derivado hidantoínico.

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4.3.1 Avaliação do efeito vasorrelaxante induzido pelos análogos estruturais de IM-7 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos normotensos.

Após um período de estabilização de 60 minutos, foi induzida uma contração com 10 M de fenilefrina (FEN), um agonista 1-adrenérgico. Para verificar a presença de endotélio foi adicionado à cuba 10 M de acetilcolina (ACh), um agonista muscarínico. Os anéis que apresentaram relaxamento causado pela ACh igual ou superior a 80% foram considerados com endotélio funcional. Já os anéis com relaxamentos inferiores a 10% foram considerados sem endotélio (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). Os anéis sem endotélio foram obtidos mecanicamente através do atrito entre as paredes internas do vaso com uma haste de metal. Os anéis com relaxamentos entre 10 e 80% foram desprezados. Após a verificação do endotélio, as preparações foram lavadas para que os valores de tensão retornassem aos valores basais.

Os efeitos vasculares de cada derivado hidantoínicos foram avaliados separadamente em anéis de artéria mesentérica com e sem endotélio. Após a verificação da presença ou ausência do endotélio, uma segunda contração com FEN (10 µM) foi induzida. No componente tônico e sustentado desta contração (aproximadamente 40 minutos), concentrações crescentes dos derivados hidantoínicos (HPA-01; HPA-02; IM-2; IM-6 e IM-3), todos análogos estruturais de IM-7, foram adicionadas cumulativamente (1 pM – 1 mM) para a obtenção de uma curva concentração-resposta para cada substância.

4.3.2. Avaliação da participação do sistema nervoso autônomo nas respostas hipotensora e bradicárdica induzidas por IM-7 em ratos normotensos não anestesiados.

Para obtenção de uma curva dose-resposta controle, os animais foram mantidos em aclimatação por um período de no mínimo 30 minutos, para estabilização dos parâmetros cardiovasculares, e em seguida foi administrado

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nitroprussiato de sódio (10 g/kg, i.v.) para verificar a eficácia da implantação do cateter venoso.

Após a obtenção de um registro controle, os animais foram tratados com hexametônio (20 mg/kg i.v.), um bloqueador ganglionar (TAKAHASHI; OWYANG, 1997; BASTOS et al., 2009). Após 30 minutos, IM-7 (1, 5, 10, 20, 30 mg/kg) foi administrada de forma aleatória. As possíveis influências do bloqueio ganglionar foram verificadas por comparações dos valores da PA e FC da condição controle com as registradas após a administração do inibidor ganglionar.

4.3.3 Avaliação da participação do NO na resposta hipotensora induzida por IM-7 em animais normotensos não anestesiados

Após um registro controle, obtido como descrito no item 4.3.2, os animais foram tratados com L-NAME (20 mg/kg, i.v.), um inibidor da NOS (RESS et al., 1990). Após 30 minutos, IM-7 (1, 5, 10, 20, 30 mg/kg) foi administrada de forma aleatória. As possíveis influências da inibição da síntese do NO foram verificadas por comparações dos valores da PA e FC da condição controle com as registradas após a administração do inibidor da enzima, utilizando a fórmula descrita no item anterior.

4.3.4 Avaliação do efeito de IM-7 sobre o cronotropismo e inotropismo em átrio isolado de ratos normotensos

Após um período de estabilização de 60 min, foi obtido um registro controle para o cronotropismo (átrio direito) e inotropismo (átrio esquerdo) cardíacos. A seguir, foi administrado 10 µM de noradrenalina (NOR) para observar os efeitos cronotrópicos e inotrópicos positivos. Após lavagem das preparações e retorno dos parâmetros atriais basais, concentrações crescentes de IM-7 (1 pM – 1 mM) foram adicionadas separadamente à cuba, de maneira cumulativa, para a obtenção de uma curva concentração-resposta. Após a aplicação de todas as concentrações de IM-7, as preparações foram lavadas a cada 15 minutos durante período de 1 hora e

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a seguir, noradrenalina (10 µM) foi novamente adicionada e seu efeito foi comparado ao observado no início do experimento.

4.3.5 Efeito da atropina sobre os efeitos inotrópico e cronotrópico negativos induzidos por IM-7.

Após um período de estabilização de 60 min, foi obtido um registro controle para o cronotropismo (átrio direito) e inotropismo (átrio esquerdo) cardíacos. A seguir atropina (0,3 µM), um antagonista muscárinico, (KANOO et al., 2009) foi adicionada à cuba e após 30 minutos, concentrações cumulativas de IM-7 (1pM – 1 mM) foram adicionadas separadamente à cuba, de maneira cumulativa, para a obtenção de uma curva concentração-resposta.

4.3.6. Avaliação do efeito vasorrelaxante induzido por IM-7 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos normotensos, pré-contraídos com KCl 80 mM

O objetivo da realização deste protocolo experimental foi analisar se IM-7 seria capaz de relaxar anéis de artéria mesentérica contraídos por solução despolarização. Após um período de estabilização de 60 minutos, e verificação da ausência do endotélio funcional, o meio nutritivo de Tyrode foi trocado por outro meio com elevada concentração de potássio (KCl 80 mM) (tabela 3), que promove uma despolarização da membrana plasmática com consequente ativação dos canais para cálcio sensíveis à voltagem (Cav). Dessa forma, ocorre o influxo de íons Ca2+ e contração muscular (REMBOLD, 1996; SAKAMOTO et al., 2003). Foram obtidas duas contrações de magnitude similares com o KCl 80 mM e na estabilização da segunda contração (tempo médio de 30 minutos), concentrações crescentes de IM- 7 (1 pM – 1 mM), foram adicionadas cumulativamente para a obtenção de uma curva concentração-resposta.

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4.3.7 Avaliação do efeito de IM-7 sobre as contrações induzidas pela adição cumulativa de ortovanadato de sódio (Na3VO4) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato normotensos

O Na3VO4, um inibidor de tirosina fosfatase, é capaz de induzir contração de músculo liso vascular (DiSALVO; SEMENCHUK; LAUER, 1993; MORI; TSUSHIMA, 2004). Esta substância foi aplicada de maneira cumulativa (10 µM – 30 mM) em anéis sem endotélio funcional em meio livre de Ca2+, para a obtenção de uma curva concentração-resposta. As preparações foram lavadas a cada 15 minutos, durante o período de 1 hora. Após período de estabilização, concentrações isoladas de IM-7 foram incubadas por 15 minutos e após esse período, uma nova curva concentração-resposta para Na3VO4 foi obtida. Os valores de tensões da segunda curva foram comparadas com os valores da primeira para avaliar o efeito de IM-7 sobre as contrações induzidas pelo Na3VO4.

4.4 Protocolos experimentais desenvolvidos com animais com hipertensão L-NAME

4.4.1 Avaliação dos efeitos induzidos por IM-7 sobre PAM e FC em ratos com hipertensão induzida pelo L-NAME.

Para registrar os efeitos de IM7 em animais hipertensos, estes foram mantidos em aclimatação por um período de no mínimo 30 minutos, para estabilização dos parâmetros cardiovasculares, e em seguida foi administrado nitroprussiato de sódio (10 g/kg, i.v.) para verificar a eficácia da implantação do cateter venoso. Após a estabilização do parâmetros cardiovasculares do animal, doses de IM-7 (1, 5, 10, 20 e 30 mg/Kg) foram administradas aleatoriamente com intervalos de tempo suficiente para que os parâmetros cardiovasculares retornassem aos seus valores basais. Os valores de PAM e FC foram computados antes (valores basais) e imediatamente após a administração de IM-7 e suas variações foram

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expressas em delta para cada dose, calculadas através da formula descrita no item 4.3.2

4.4.2 Verificação da participação dos receptores muscarínicos nos efeitos hipotensor e bradicardico induzidos por IM-7 em ratos hipertensos

Após a obtenção de um registro controle, os animais foram tratados com atropina (2 mg/kg i.v.), um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos (KWAN, et al., 2003). Após 15 minutos, IM-7 (20 mg/kg) foi administrada. As possíveis influências da inibição dos receptores muscarínicos foram verificadas por comparações dos valores da PA e FC da condição controle com as registradas após a administração do antagonista muscarínico, utilizando a fórmula descrita no item 4.3.2

4.4.3. Avaliação do efeito de IM-7 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato hipertenso

A obtenção e preparação dos anéis de artéria mesentérica foi realizada como descrito anteriormente para os ratos normotensos (item 4.3.1). Para a verificação da presença ou ausência do endotélio vascular, os anéis de ratos hipertensos foram contraídos com 3 µM de fenilefrina. Esta concentração é relatada na literatura em estudos com anéis de artéria mesentérica superior de ratos com hipertensão L-NAME (HEIJENBROK et al., 2000). A presença do endotélio vascular foi verificada pelo relaxamento dos anéis após a adição de ACh de maneira cumulativa (1 nM à 10 µM).

Após a obtenção de uma segunda contração com 3 µM de FEN (aproximadamente 40 minutos), concentrações crescentes de IM-7 (1 pM - 1 mM) foram adicionadas às cubas de maneira cumulativa para a obtenção de uma curva concentração-resposta, tanto na presença quanto na ausência do endotélio vascular para a obtenção de uma curva concentração-resposta (controle). Para o estudo do

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mecanismo da ação vasorrelaxante induzida por IM-7, diversas ferramentas farmacológicas foram incubadas antes da segunda contração induzida pela FEN (3 µM). Para cada ferramenta, foram utilizadas preparações diferentes.

4.4.4 Verificação do efeito de IM-7 sobre a resposta contrátil induzida por FEN em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos

Em anéis sem endotélio funcional, FEN foi aplicada de maneira cumulativa (1 nM - 10 µM) para a obtenção de uma curva concentração-resposta. As preparações foram lavadas para induzir o retorno do tônus vascular aos valores de tensão iniciais. Após período de estabilização, concentrações isoladas de IM-7 foram incubadas por 15 minutos e após esse período, uma nova curva concentração- resposta para a FEN foi obtida. Os valores de tensões da segunda curva foram comparados com os valores da primeira para avaliar o efeito de IM-7 sobre as contrações induzidas pela FEN.

4.4.5 Análise do efeito de IM-7 sobre a resposta contrátil induzida por serotonina em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos

Após a verificação da ausência do endotélio funcional, foram obtidas duas contrações de magnitude similares decorrentes da administração de 10 µM de serotonina (5-HT), uma substância conhecida por ser capaz de induzir contração de músculo liso vascular (WANG et al., 2008; WATTS;DAVIS, 2010). Após lavagem e estabilização, IM-7 (1 mM) foi incubada por um período de 15 minutos. A seguir, uma nova contração para 5-HT foi obtida. O efeito inibitório de IM-7 sobre as contrações induzidas por 5-HT foi calculado comparando-se as magnitudes das respostas contráteis obtidas na ausência e na presença de IM-7.

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4.4.6 Verificação da participação da enzima NOS na resposta vasorrelaxante induzida por IM-7 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos.

O NO é um agente vasodilatador formado a partir do aminoácido L-arginina pela ação de enzima NOS nas células endoteliais (BOGER; RON, 2005). Com a finalidade de avaliarmos a participação desta enzima na atividade de IM-7, os anéis providos de endotélio funcional foram incubados por um período de 30 minutos, com L-NAME (100 M), um inibidor competitivo da NOS (REES et al., 1990). Após este período de incubação, uma nova contração foi induzida pela administração de FEN (3 M) e no componente tônico desta IM-7 foi administrada de maneira cumulativa (1 pM - 1 mM) para obtenção de uma curva concentração-resposta. As respostas obtidas foram comparadas com a condição controle, ou seja, na ausência do L- NAME. A potência vasorrelaxante do IM-7 foi avaliada através de comparação dos valores de pD2 e Emáx na presença e na ausência de L-NAME.

4.4.7 Influência da inibição da enzima sGC na resposta vasorrelaxante induzida por IM-7 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos.

Com a finalidade de investigar a participação da via NO-sGC na resposta vasorrelaxante promovida por IM-7, anéis com endotélio vascular, foram pré-incubados com ODQ (10 µM), um inibidor específico da sGC (GARTHWAITE et al., 1995, PIMENTEL et al., 2007). Decorridos 30 minutos as preparações foram submetidas a uma segunda contração com FEN e no componente tônico desta contração foi adicionado IM-7 (1 pM – 1 mM) cumulativamente, para obtenção de uma curva concentração-resposta. As respostas obtidas foram comparadas com a condição controle, ou seja, na ausência do ODQ. A potência vasorrelaxante do IM-7 foi avaliada através de comparação dos valores de pD2 e Emáx na presença e na ausência de ODQ.

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4.4.8 Verificação do envolvimento dos receptores muscarínicos na resposta vasorrelaxante induzida por IM-7 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos.

A participação dos receptores muscarínicos no efeito vasorelaxante de IM-7, foi realizada em anéis com endotélio funcional, que foram incubados durante 30 minutos com atropina (1 nM ou 100 nM), um antagonista não-seletivo dos receptores muscarínicos (SHIRAKI et al., 2001). Concentrações crescentes de IM-7 (1 pM - 1 mM) foram administradas no componente tônico da contração induzida com FEN .

4.4.9 Avaliação da participação dos canais para K+_{no efeito vasorrelaxante de IM-7} em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos.

Para estudarmos a possível participação dos canais para K+ no efeito relaxante do IM-7, o meio de Tyrode foi trocado pelo Tyrode despolarizante – KCl 20 mM (tabela 2), o qual permaneceu até o final do experimento. Este procedimento impede parcialmente o efluxo de íons K+ e atenua relaxamentos mediados por abertura de canais para K+ (CAMPBELL et al., 1986; CLARK; FUCHS, 1997). Após 30 minutos da troca da solução, os anéis, sem endotélio funcional, foram contraídos com FEN e no componente tônico desta contração, IM-7 foi administrada de maneira cumulativa (1 pM - 1 mM).

4.4.10 Avaliação do efeito vasorrelaxante induzido por IM-7 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos, pré-contraídos com KCl 80 mM

Após um período de estabilização de 60 minutos, e verificação da ausência do endotélio funcional, o meio nutritivo de Tyrode foi trocado por outro meio com elevada concentração de potássio (KCl 80 mM) (tabela 3), que promove uma

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despolarização da membrana plasmática com consequente ativação dos canais para cálcio sensíveis à voltagem (Cav). Dessa forma, ocorre o influxo de íons Ca2+ e contração muscular (REMBOLD, 1996; SAKAMOTO et al., 2003). Foram obtidas duas contrações de magnitude similares com o KCl 80 mM e na estabilização da segunda contração (tempo médio de 30 minutos), concentrações crescentes de IM- 7 (1 pM – 1 mM), foram adicionadas cumulativamente para a obtenção de uma curva concentração-resposta.

4.4.11 Avaliação do efeito de IM-7 sobre as contrações induzidas pela adição cumulativa de CaCl2 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato

Este protocolo teve como objetivo avaliar um possível efeito de IM-7 sobre o influxo de Ca+2 através dos canais para cálcio operados por voltagem (Cav) em anéis despolarizados. Após a verificação da ausência de endotélio funcional como descrito no item 4.2.4, uma segunda contração foi obtida devido à substituição do Tyrode normal por uma solução de Tyrode despolarizante KCl 60 mM (tabela 4). A seguir, a preparações foram lavadas com Tyrode normal, retornando às condições normais de tônus e foram incubadas por 15 minutos em uma solução de Tyrode nominalmente sem Ca+2 (tabela 7). Ao término desse período, o meio foi permutado por uma solução de Tyrode despolarizante KCl 60 mM nominalmente sem Ca+2 (tabela 5), não sendo observada nenhuma contração. O CaCl2 foi adicionado, de maneira cumulativa (1 µM- 30 mM), para obtenção de uma curva controle.

Os anéis foram lavados com Tyrode normal para que retornassem aos valores normais de tensão e o processo descrito anteriormente foi repetido. No entanto, a curva concentração-resposta para o CaCl2 foi obtida na presença de concentrações isoladas de IM-7 (10 M, 100 M e 1 mM). Os valores das tensões da segunda curva foram comparados com os valores da primeira curva para avaliar o efeito de IM-7 sobre as contrações induzidas por CaCl2.

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4.4.12 Análise dos efeitos de IM-7 sobre a mobilização de Ca2+_{dos estoques} intracelulares sensíveis à FEN

O objetivo desse protocolo foi avaliar o efeito de IM-7 sobre as contrações promovidas pela FEN (10 M), decorrentes da liberação de íons Ca+2 dos estoques intracelulares.

Após a verificação da ausência do endotélio funcional, os anéis foram expostos a uma solução de KCl 60 mM (tabela 4) para verificar a responsividade do tecido. O meio foi então trocado por uma solução de Tyrode livre de Ca+2 para retirar a influência do influxo desse íon induzida pela FEN. Decorridos 2-3 minutos, aplicou- se FEN (10 M), obtendo-se uma contração transiente. Esse processo foi repetido na presença de concentrações isoladas de IM-7 (10 M, 100 M e 1 mM). Após a substituição do meio de Tyrode livre de Ca+2_{, IM-7 foi incubada por 3 minutos e após} esse período uma nova resposta contrátil à FEN (10 M) foi obtida. Um possível efeito inibitório de IM-7 nas contrações transientes foi calculado comparando-se as magnitudes das respostas contráteis obtidas na ausência e na presença de IM-7.

4.4.13 Avaliação do efeito de IM-7 sobre as contrações induzidas pela adição cumulativa de ortovanadato de sódio (Na3VO4) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos hipertensos

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4.5 Análise estatística

Os valores estão expressos como média  erro padrão da média (e.p.m). Os testes t de Student não pareado e análise de variância (ANOVA), seguida de Bonferroni foram utilizados, quando necessário para avaliar a significância das diferenças entre as médias. Foram considerados valores estatisticamente significantes quando o p < 0,05. Os valores de pD2 (logaritmo negativo da concentração responsável por 50% do efeito máximo) foram obtidos através de

No documento Avaliação dos mecanismos determinantes dos efeitos cardiovasculares promovidos pelo IM-7 em ratos com hipertensão induzida pelo L-NAME : abordagens in vivo e in vitro (páginas 46-145)