Se emplearon ratas (Rattus novergicus) cepa Holtzman de 200 a 250 g de peso y ratones cepa Balb entre 25 – 30 g de peso, todos en buen estado de salud, adquiridos en el Bioterio de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (Anexo 2), los que fueron alojados en jaulas metálicas de crianza para su aclimatación por una semana previa a los ensayos, con agua y alimento ad libitum. La temperatura ambiental fue de 22-27 °C y 70-80 % de humedad relativa con 12 horas de luz/oscuridad. La investigación se llevó a cabo cumpliendo debidamente las normas de ética para el uso de animales de experimentación (según Guía de manejo y cuidado de animales de laboratorio - Ética de la experimentación animal. MINSA–INS)67.
35 3.2.4. Ensayos fisicoquímicos
3.2.5.1. Determinación de la solubilidad
Se utilizó como muestra problema 10 mg de extracto hidroalcohólico seco al que se agregó un mL de solvente. Los solventes utilizados fueron: n-hexano, éter etílico, diclorometano, cloroformo, metanol, agua, butanol y etanol68 (Anexo 4).
3.2.5.2. Marcha fitoquímica.
Tiene como objetivo determinar los metabolitos secundarios de la especie vegetal68, 69 (Anexo 5).
Detección de alcaloides
Se utilizó 50 mg de extracto libre de solvente, fueron agitados con diez mL de ácido clorhídrico diluido y posteriormente fueron filtrados. El filtrado se ensayó cuidadosamente con varios reactivos para la identificación de alcaloides como:
Prueba de Dragendorff
A tres mL de filtrado, se añadió un mL de reactivo de Dragendorff. Un precipitado amarillo prominente indica que la prueba es positiva.
Prueba de Mayer
A dos mL de filtrado, se añadieron dos gotas de reactivo de Mayer por las paredes del tubo de ensayo. Un precipitado blanco o cremoso indica que la prueba es positiva.
Prueba de Popoff
A dos mL de filtrado, se añadieron dos gotas de reactivo de Popoff por las paredes del tubo de ensayo. Un precipitado amarillo indica que la prueba es positiva.
36 Detección de componentes fenólicos y taninos
Reacción de Shinoda: detección de flavonoides
El extracto (50 mg) se disolvió en cinco mL de agua y se añadió fragmentos de magnesio metálico y ácido clorhídrico concentrado (gota a gota). Si se desarrolla color rosado a carmesí, se deduce la presencia de flavonol-glucósidos.
Prueba Salkowski: flavonoides con núcleo esteroidal
Se tomó 50 mg de muestra en un mL de cloroformo, se disolvió en un mL de ácido sulfúrico concentrado. La prueba es positiva flavonas y flavonoles si se observaran coloraciones amarillas; para flavonas coloraciones naranja-guinda, para chalconas coloraciones rojo-azuloso, y la presencia de quinonas se detecta con coloraciones rojo-púrpura.
Prueba de cloruro férrico: compuestos fenólicos
El extracto (50 mg) se disolvió en cinco mL de agua destilada y se le añadió cuatro gotas de solución de tricloruro férrico al 5 % neutro. Un color verde oscuro indica la presencia de compuestos fenólicos.
Prueba de Gelatina: detección de taninos.
El extracto (50 mg) se disolvió en cinco mL de agua destilada y se le añadió dos mL de una soluc. de gelatina (1%) que contiene cloruro sódico al 10 %.
El precipitado blanco indica la presencia de compuestos fenólicos.
Detección de fitoesteroles
Prueba de Liebermann-Burchard: detección de triterpenoides y esteroides
El extracto (50 mg) se disolvió en dos mL de anhídrido acético y se le añadió lentamente dos gotas de ácido sulfúrico concentrado por las paredes
37 del tubo de ensayo. Cambios de colores en tonalidades de rojo, azul o verde muestra la presencia de fitoesteroles.
Determinación de carbohidratos
Prueba de Molish
A dos mL de filtrado, se añadieron dos gotas de solución alcohólica de alfa-naftol, se agitó bien la mezcla y se añadió lentamente un mL de ácido sulfúrico concentrado a lo largo de los lados del tubo de ensayo y se dejó reposar. Un anillo violeta indica la presencia de carbohidratos.
Detección de glicósidos
Se hidrolizaron 50 mg de extracto con ácido clorhídrico concentrado durante 2 horas en un baño de agua, se filtró y el hidrolizado se sometió a los siguientes ensayos.
Prueba de Baljet: detección de lactonas
Se utilizó dos soluciones que se mezclan en iguales volúmenes antes de usarse. Solución A: se coloca un gramo de ácido pícrico en 100 mL de etanol. Solución B: Se agregan diez gramos de NaOH en 100 mL de agua.
Para la prueba se agregó 100 L de la muestra y tres gotas del reactivo. La prueba es positiva si adquiere una coloración naranja o rojo oscuro.
Prueba de Borntrager: detección de quinonas
A dos mL de hidrolizado filtrado, se añadieron tres mL de cloroformo y se agitaron, se separa la capa de cloroformo y se le añadió la solución de amoníaco al 10 %. El color rosa indica la presencia de glicósidos.
38
Prueba de Keller-Killiani: detección de desoxiázucares
Se tomó un mL de muestra y se disolvió en dos mL de reactivo de Keller, luego se agregó por las paredes del tubo dos mL de reactivo de Killiani. En la zona de contacto de los dos líquidos se produce un anillo color rosa o rojo pardo.
Detección de aminoácidos libres
El extracto (100 mg) se disolvió en diez mL de agua destilada y se filtró a través de un papel de filtro, el filtrado se sometió a la prueba para aminoácidos libres.
Prueba de Ninhidrina
Se añadió dos gotas de solución de Ninhidrina (10 mg de ninhidrina en 200 mL de acetona) a dos mL de filtrado acuoso. Un color púrpura característico indica la presencia de aminoácidos.
Detección de saponinas
El extracto (50 mg) se diluyó con agua destilada y se completó hasta 20 mL. La suspensión se agitó en una probeta durante 15 min. Una capa de espuma mayor a dos centímetros indica la presencia de saponinas.
3.2.5.3. Cromatografía en capa fina
Se utilizaron placas comerciales de sílica gel 60 GF 254 Merck, de 10 cm x 10 cm x 0,25 mm y placas de 20 x 20 cm x 0,25 mm con un indicador fluorescente. Las placas se desarrollaron en el sistema de fase móvil de tolueno: acetato de etilo: ácido fórmico (36:12:5). Se utilizó una técnica ascendente con desarrollo simple. El extracto seco se disolvió en agua y posteriormente se extrajo con acetato de etilo, la porción de acetato de etilo fue evaporada hasta sequedad y luego se reconstituyó con metanol para su
39 posterior sembrado en la placa cromatográfica. Para la identificación de las manchas se utilizó una lámpara UV con posibilidad de hacer observaciones de fluorescencia a 254 y 366 ηm. Los metabolitos secundarios encontrados fueron separados (por raspado) y disueltos con metanol absoluto, luego se filtró y las alícuotas obtenidas se emplearon en la identificación de posibles metabolitos mediante Espectroscopia UV-Visible. (Anexo 6)
Las fracciones que presentaron fluorescencia frente al UV a 366 ηm se llevaron al análisis espectrofotométrico UV, finalmente se analizó los espectros UV de estas fracciones y permitió identificar dos posibles metabolitos flavonoidales y compararlos con una tabla de referencia70.
3.2.5. Ensayos biológicos