Preparo das lâminas histológicas

Para a realização dos cortes histológicos, foram retirados os corações e posteriormente o ventrículo esquerdo com auxílio de um bisturi. Após a fixação dos tecidos em formalina tamponada 10%, as peças foram submetidas às seguintes metodologias: Para a preparação das peças e realização dos cortes histológicos do VE, processamos a desidratação, clareamento, impregnação, inclusão e a coloração com auxílio de materiais como cassete (Lupe), pinças, béqueres, cronômetro, proveta, estufa, geladeira, micrótomo (Lupetec), lâminas silanizadas (Starfrost), lamínulas (EasyPath), resina Permount (Fisher Scientific) e o microscópio (Leitz Aristoplan) para visualização dos cortes preparados. Inicialmente, os procedimentos de Desidratação, Clareamento e Impregnação foram realizados. Para isto, colocamos os VE, dentro dos cassetes (Lupe) nas seguintes soluções e nos tempos indicados:

44 Tabela 1 - Sequência de desidratação, clareamento e impregnação e os tempos de cada fase

utilizados para processamento histológico.

DESIDRATAÇÃO TEMPO

Álcool 70% 60 minutos

Álcool 80% 60 minutos

Álcool 95% 60 minutos

Álcool absoluto I 60 minutos

Álcool absoluto II 60 minutos

Álcool absoluto III 60 minutos

Álcool absoluto / xilol 60 minutos

CLAREAMENTO TEMPO

Xilol I 30 minutos

Xilol II 30 minutos

Xilol III 60 minutos

IMPREGNAÇÃO TEMPO

Parafina I 60 minutos

Parafina II 60 minutos

Parafina III 120 minutos

Após estes procedimentos, realizamos a inclusão da peça no molde de parafina (Erviplast), onde ela é inclusa no centro do molde até completa solidificação. A peça foi moldada de acordo com o tamanho do micrótomo. Fizemos cortes de 5 m que foram levados a estufa em temperatura aproximada de 60ºC. Os cortes foram colocados na lâmina e corados com a Hematoxilina (10%) e Eosina (10%) (Synth) e Picrosirius Red (0,1%) (Sirius Red F 3B 200, Mobay Chemical CO, Union, NJ, USA).

O corante básico, a hematoxilina, cora as estruturas de característica ácida em azul (núcleo, ribossomos e retículo endoplasmático rugoso) enquanto a eosina, um corante ácido, cora as estruturas de características alcalina em rosa -

45 avermelhado. Como a maioria das proteínas citoplasmáticas é básica, em uma coloração com HE, o citoplasma usualmente se cora em rosa - avermelhado e os núcleos em azul. Esta técnica pode ser usada para detecção de hipertrofia cardíaca. Com o intuito de verificar a presença de colágeno no miocárdio, utilizamos a solução de Picrosirius Red. As colorações foram feitas seguindo as etapas abaixo descritas sequencialmente para HE e Picrosirius Red, respectivamente:

Tabela 2 - Sequência de solução e tempo para a coloração com Hematoxilina-Eosina e Picrosirius Red.

SOLUÇÃO TEMPO SOLUÇÃO TEMPO

Xilol I 10 minutos Xilol I 10 minutos

Xilol II 10 minutos Xilol II 10 minutos

Álcool absoluto 2 minutos Álcool absoluto 2 minutos

Álcool 95% 2 minutos Álcool 95% 2 minutos

Álcool 90% 2 minutos Álcool 90% 2 minutos

Álcool 70% 2 minutos Álcool 70% 2 minutos

Água 2 minutos Água 2 minutos

Hematoxilina 6 minutos Picrosirius Red 8 minutos

Eosina 3 minutos Água 2 minutos

Água 2 minutos Álcool 70% Passagem

Álcool 70% 30 segundos Álcool 95% Passagem

Álcool 95% 30 segundos Álcool absoluto Passagem Álcool absoluto 30 segundos Álcool absoluto/ xilol 1 minuto

Álcool absoluto/ xilol 1 minuto Xilol I 5 minutos

Xilol I 10 minutos Xilol II 10 minutos

Xilol II 10 minutos Xilol III 10 minutos

Xilol III 10 minutos

Após a coloração, as lamínulas foram fixadas nas lâminas com permount, estando pronta para a visualização no microscópio.

46 C) Análise Morfométrica Quantitativa

A análise morfométrica quantitativa das células foi realizada segundo a avaliação quantitativa realizada por meio de análise das imagens digitais com utilização de sistema composto por microscópio óptico (Leitz Aristoplan) conectado a um computador por uma câmera de vídeo. A lente, a intensidade da luz do microscópio e a altura do condensador foram padronizadas. Os cortes histológicos, n=5 por grupo, dos ventrículos esquerdos foram fotografados em sete campos escolhidos por lâmina em aumento de 400 vezes utilizando o software AxioVision Documentation (Carl Zeiss Video Image, MD, USA).

Na literatura são encontrados diferentes maneiras que avaliam a hipertrofia ventricular, que pode ser por análise do número de células (TATÍC et al., 2012), tamanho das células (GUPTA et al., 2012), espessura e disposição da miofibrila (HE

et al., 2012) ou através da área de secção transversal dos cardiomióctios (LU et al.,

2012). Em nosso estudo, para realizarmos a análise da hipertrofia ventricular, avaliamos o menor diâmetro dos cardiomiócitos, seguindo a técnica padronizada no laboratório do Dr Rubens Fazan Junior, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento de Fisiologia da Universidade de São Paulo/USP. Optamos por fazer esta análise, pois, assim como eles, nos baseamos na seguinte explicação: a figura abaixo mostra que a área da secção transversal reflete o tamanho do miócito quando é tomada apenas com um ângulo de 90º em relação ao eixo da fibra cardíaca. Esta figura mostra ainda que a área da secção transversal do miócito aumenta com a variação do ângulo formado, enquanto que o menor diâmetro do miócito não. Portanto, a área da secção transversal do miócito não seria o melhor indicador do tamanho do miócito, uma vez que não é possível ter sempre uma área da secção transversal perpendicular em relação ao eixo do miócito, passamos a analisar o menor diâmetro em vez da área de secção transversal.

47 Figura 2 - Variação do tamanho do miócito em função do ângulo de secção transversal da fibra cardíaca. Figura cedida gentilmente pelo Laboratório do Prof Dr Rubens Fazan Junior (FMRP-USP).

As imagens capturadas foram analisadas com a utilização do software Image J. O menor diâmetro dos cardiomiócitos foi determinado a partir de 25 medições em cada ventrículo distribuídas aleatoriamente nos sete campos fotografados, que foram feitas com uma ampliação de 400x, em miofibrilas orientadas longitudinalmente, onde o menor diâmetro foi obtido na região do núcleo que foi claramente delimitado pela membrana nuclear. A quantidade de colágeno foi expressa em porcentagem da área total de tecido (ventrículo esquerdo) obtida nas imagens capturadas de cada corte de ventrículo. Na imagem fotografada foram quantificadas as áreas ocupadas por fibras colágenas e a área total do tecido. Para cada ventrículo foram avaliados 3 diferentes cortes. Em cada corte foram avaliadas 3-4 áreas totais e a partir destas foi calculada a média das porcentagens de fibras colágenas. Altura: 1,8 cm Largura: 2,8 cm Área: 3,95 cm2 Altura: 1,8 cm Largura: 3,4 cm Área: 4,80 cm2

48 3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA