Preparo dos eletrodos enzimáticos

O método de preparo dos biossensores enzimáticos baseou-se no método bastante explorado nas últimas décadas denominado de síntese template, a qual consiste em uma reação do tipo hospedeiro/convidado. Neste caso, a síntese do convidado é realizada no interior de cavidades ou poros denominados de estruturas hospedeiras, criadas pela corrosão eletroquímica de um filme de alumínio.

Para o preparo dos eletrodos enzimáticos foram utilizados filmes de alumínio de área 0,75 x 2,05 cm2 _{x 30 µm (Alcoa, 99,9%). Inicialmente os filmes foram lavados com solução de lauril}

sulfato de sódio a 1% (m:v) em banho de ultra-som e em seguida lavados com água destilada. Os filmes foram finalmente lavados com álcool etílico e seco sob vácuo, à temperatura ambiente (25°C) por 24 horas antes de sua utilização.

A solução para a polimerização eletroquímica, consistiu de anilina bidestilada (0,1M, Sigma-Aldrich), o dendrímero bioconjugado com os biocatalizadores e ácido p-tolueno sulfônico (1M, Sigma/Aldrich) em solução tampão fosfato de sódio salino (NaPBS) (0.1M, NaH2PO4/Na2HPO4, 0.05 mol.L-1 NaCl, pH 7.4) como eletrólito. O crescimento dos nanotubos

foi obtido em um ciclo potencial de -100mV e 30 mC versus um eletrodo saturado de calomelano, de forma a se obter PANINT’s no seu estado reduzido. Após o processo de deposição eletroquímica, os eletrodos foram lavados com solução PBS pH 7,4 e armazenado em NaPBS por 24 h para remover qualquer excesso de monômero residual ou bioconjugados que não tenham sido imobilizados completamente. A microestrutura dos eletrodos enzimáticos obtidos foi caracterizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Um microscópio MEV modelo JEOL XL 30 foi utilizado no presente trabalho. As amostras foram previamente recobertas com Au para o respectivo contato. A Figura 7.3 ilustra a imobilização dos bioconjugados (vermelho) nos nanotubos de polianilina.

Aspectos Bioeletroquímicos de Dendrímeros como Nanoplataformas para Aplicações Clínicas

Figura 7.3- Ilustração do biossensor preparado neste trabalho através da técnica de imobilização física dos bioconjugados nos nanotubos de polianilina.

A bioatividade dos eletrodos foram medidas amperometricamente pela corrente produzida no eletrodo enzimático devido à formação de peróxido de hidrogênio gerado pela catálise enzimática da GOx e COx ou formação de íons NH4+ (urease). Neste caso, a corrente elétrica

produzida demonstrou ser proporcional à concentração dos substratos. Um volume de 10 µL da solução do substrato considerado foi depositado sobre o eletrodo trabalho (eletrodos enzimáticos baseados nos dendrímeros bioconjugados). Um eletrodo saturado de calomelano (SCE, Ag/AgCl) foi utilizado como eletrodo de referência. Para eliminar os efeitos de potencial e oscilações de pH e temperatura na condutividade dos PANINT’S considerou-se a corrente resposta do biossensor como a diferença entre a corrente de fundo e a corrente contendo a solução do analito a se dosar. O fluxo de corrente medido no biossensor resultante da atividade enzimática foi medido com o auxílio de um eletrômetro programável (Keithley modelo 237), de acordo com a Figura 7.4.

Figura 7.4– Unidade fonte medidora Keithley modelo 237 utilizado na caracterização do dispositivo biossensor.

As curvas das correntes em função da tensão (curva I x V) foram obtidas através de uma fonte tensão/corrente Keitlhey, modelo 237 (K237). O Keitlhey K237 é uma unidade fonte- medidora de alta precisão, fundamental à realização de medidas de tensão de 10V a 1100 V, e medidas de corrente de 10 fA a 100 mA, escalas estas fundamentais às medidas de baixos sinais e quaisquer outras que exijam precisão. Para o controle automatizado de aquisição de dados, este instrumento possui interface IEEE-488 padrão, o que permite a programação via computador.

Quando programado como fonte de tensão, o amperímetro conecta-se em série com a fonte de tensão e a saída. Quando programado como fonte de corrente, o voltímetro conecta-se em paralelo entre fonte de corrente e saída.

Como proteção ao circuito externo, o modelo K237 possui um limite de concordância programável, o qual nunca é excedida pela unidade fonte-medidora. Ajustando-se uma corrente de concordância apropriada pode-se prevenir dissipação excessiva de energia do dispositivo. Ajustando-se uma tensão de concordância apropriada pode-se proteger o dispositivo de uma sobretensão.

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A escala de concordância selecionada é também a escala máxima medida. Em todo caso, quando a função AUTORANGE está habilitada, a unidade fonte-medidora sempre irá para a menor, mais sensível, escala possível para que a medição seja feita.

O controle e a aquisição de dados foram feitos utilizando-se um sistema automatizado baseado na plataforma HP VEE 4.0, software com linguagem orientada a objeto e que controla os instrumentos de medição através de interfaces de comunicação GPIB 488.

O HP4284A oferece medidas em todas as frequências com resolução de seis dígitos e níveis de sinal de teste de 5mV a 2Vrms e 50µA a 20mArms; possui interface IEEE-488 padrão, o

que permite programação via microcomputador.

A aquisição de dados e o controle dos equipamentos durante os experimentos foram realizados utilizando-se de programas elaborados na plataforma Labview 6.1, um software que utiliza linguagem orientada a objeto para realização dos procedimentos de controle em ambientes de pesquisa, permitindo elaborar tais sistemas sem a utilização de controladores específicos, pois é capaz de simulá-los através de rotinas de software.

Para obtenção da rede neural foi utilizado como ferramenta o Nets 3.0, sendo trabalhado em linguagem C:. A topologia da RNA utilizada foi um perceptron multicamada com uma camada de entrada contendo três neurônios, uma camada escondida com dez neurônios e três neurônios na camada de saída. Os sinais de entrada da rede são as correntes geradas no biossensor presente nos conjuntos determinados, como pode ser observado na Figura 7.5. Foram ensaiados vários números de neurônios na camada escondida, buscando a otimização dos resultados. Também, várias taxas de aprendizagem foram utilizadas. A cada simulação, os pesos sinápticos iniciais foram escolhidos aleatoriamente, utilizando-se um gerador de números randômicos no intervalo ] 1 , 1 [- , seguindo uma distribuição uniforme de média 0 (zero). A função de ativação utilizada foi a função sigmóide tangente hiperbólica.

Figura 7.5- Ilustração da configuração da rede neural artificial utilizada neste trabalho.

7.4- Referências

[1] GIAROLA, V. M. Ressonância de plásmons de superfície aplicada ao desenvolvimento de sistemas arborescentes hemocompatíveis. 2007, Dissertação (Mestrado em Engenharia de Materiais). Universidade Federal de Itajubá (UNIFEI). Orientador: Prof. Dr. Álvaro A. A. de Queiroz.

[2] DE QUEIROZ,A.A.A.; ABRAHAM,G.A.; CAMILLO,M.A.P.; HIGA, O.Z.; SILVA, G.S.; FERNÁNDEZ, M.M.; ROMÁN, J.S. Physicochemical and antimicrobial properties of boron- complexed polyglycerol–chitosan dendrimers, J. Biomater. Sci. Polymer Edn, v. 17, n. 6, p. 689–707, 2006.

[3] DE QUEIROZ A.A.A.; FERNANDES, E.G.R.; ABRAHAM, G.A.; ROMAN, J.S.; Antithrombogenic properties of bioconjugate streptokinase-polyglycerol dendrimers. Journal of Materials Science. Materials in Medicine, Estados Unidos, v. 17, p. 105-111, 2006.

[4] DE QUEIROZ A.A.A.; ABRAHAM, G.A.; CAMILO, M. A. P.; HIGA, O.Z.; SILVA, G.S. ; FERNÁNDEZ, M.D.M.; ROMAN, J. S. Physicochemical and antimicrobial properties of boron- complexed polyglycerol-chitosan dendrimers. Journal of Biomaterials Science. Polymer Edition, Netherlands, v. 17, n. 6, p. 689-707, 2006.

[5] VIEIRA, N.C.S. Biossensores de glicose nanoestruturados baseados em dendrímeros PAMAM e filmes finos de In2O3:Sn. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Itajubá

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[6]FERNANDES, E.G.R. Biossensores nanoestruturados para monitoração de glicose. 2005. 175 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Materiais) – Universidade Federal de Itajubá. Orientador: Prof. Dr. Álvaro A.A. de Queiroz.

[7] DE QUEIROZ, A.A.A.; VARGAS, R.R.; HIGA, O.Z.; RIBEIRO, R.R.; VITOLO, M. Lactam-amide graft copolymers as novel support for enzyme immobilization. J Appl Polym Sci; v.84, p.767-77, 2002.