PREPARO E CONSERVAÇÃO DAS AMOSTRAS DE CAMPO

Chegando ao IBMP, as amostras com 4 mL de sangue total bovino foram imediatamente processadas, segundo o exposto abaixo:

1. Retirou-se os tubos da caixa de isopor, mantendo-se os mesmos em estantes, em repouso durante 20 minutos, para as amostras atingirem a temperatura ambiente.

2. Pesou-se os tubos, com a finalidade de equilibrá-los adequadamente na centrífuga.

3. Os tubos foram invertidos suave e repetidamente, com a finalidade de homogeneizar as amostras.

4. Centrifugou-se as amostras a 1.228 X g (3.100 rpm) durante 30 minutos em centrífuga clínica MediSpin^ IEC.

Após esse período de centrifugação, houve a separação dos elementos sólidos (eritrócitos e “buffy coat”) e da parte líquida do sangue, ou seja, o plasma sangüíneo, conforme mostra a figura 2 adiante.

Para os testes de AGID e ELISA, os quais avaliam a resposta imune do animal pela verificação da presença de anticorpos direcionados ao VLB, utilizou-se o plasma sangüíneo como amostra-teste. No caso da técnica da PCR - TR, foi necessária a extração do DNA dos linfócitos circulantes para a detecção do DNA proviral integrado ao mesmo, quando da presença da infecção viral, sendo que, para tal, as células linfocitárias foram previamente separadas da camada “buffy coat”.

FIGURA 2 - CENTRIFUGAÇÃO DO SANGUE TOTAL PARA A OBTENÇÃO DO PLASMA SANGÜÍNEO E DO “BUFFY COAT”

2.6.3.1 Colheita e conservação do plasma sangüíneo

Findo o processo de centrifugação, colheu-se individualmente da fase superior de cada tubo, o plasma sangüíneo, com o auxílio de uma micropipeta.

Esse material biológico foi distribuído em alíquotas de 500 L, em tubos do tipo Eppendorf previamente identificados com o número de cada amostra.

Conservou-se em “freezer” a 20 ^oC negativos as amostras de plasma sangüíneo para utilização nos testes de AGID e ELISA.

A metodologia descrita acima, utilizada para a obtenção e conservação do plasma sangüíneo dos bovinos incluídos nesse estudo, foi também empregada para o sangue da ovelha colhido antes e após a infecção viral para análise pela prova de AGID.

2.6.3.2 Obtenção do DNA linfocitário

Depois da retirada do plasma sangüíneo de cada tubo, a porção intermediária “buffy coat”, constituída pelos leucócitos e pelas plaquetas, foi colhida utilizando-se uma pipeta plástica descartável do tipo Pasteur.

Centrífuga Sangue total

com anticoagulante

Plasma

“Buffy coat”

Eritrócitos

Individualmente, para cada amostra, diluiu-se e homogeneizou-se a camada contendo os glóbulos brancos em 4 mL de solução salina balanceada, cujo preparo descreveu-se no anexo 6.

Em tubos de centrífuga da marca Falcon, devidamente identificados com o número das amostras, contendo 3 mL de Ficoll-Paque Plus (Amersham, Biosciences), a suspensão de células brancas foi cuidadosamente disposta, de modo a não interferir com o reagente já presente nos tubos. Centrifugou-se a 1.228 X g, durante 40 minutos, em temperatura ambiente.

A migração diferencial, durante o processo de centrifugação, resultou na formação de camadas contendo diferentes tipos celulares. Os linfócitos, devido a sua menor densidade, formaram um halo branco entre a fase líquida superior e o Ficoll-Paque Plus, de acordo com o desenho apresentado na figura 3.

FIGURA 3 - SEPARAÇÃO DAS CÉLULAS LINFOCITÁRIAS POR MEIO DE CENTRIFUGAÇÃO, UTILIZANDO FICOLL-PAQUE PLUS

Para a separação das células linfocitárias, retirou-se, primeiramente, com uma pipeta Pasteur, a fase líquida superior, que foi descartada de acordo como exposto na observação a seguir. Posteriormente, com cuidado, sem interferir no Ficoll-Paque Plus, removeu-se, também com uma pipeta Pasteur, o anel esbranquiçado contendo os linfócitos.

Esse material foi disposto individualmente em tubos Eppendorf identificados, sendo centrifugado em microcentrífuga Eppendorf (modelo 5415 D) a 400 X g durante 10 minutos. Desprezou-se o sobrenadante e o sedimento

Centrífuga

“Buffy coat” diluído em salina balanceada

Ficoll-Paque Plus Ficoll-Paque Plus

e outras células Linfócitos Fase líquida

celular foi armazenado em “freezer” a 20 ^oC negativos, para posterior processamento.

Observação: todo material proveniente do processamento das amostras de sangue foi descartado e mantido em solução de hipoclorito de sódio a 5 % durante, no mínimo, 16 horas antes de sua eliminação na rede sanitária. A preparação da solução de hipoclorito de sódio foi relatada no anexo 7.

Após a separação dos linfócitos, conforme explicado acima, extraiu-se o DNA dessas células, utilizando-se um kit de extração de DNA genômico para células e tecidos da Pharmacia, Biotech (RapidPrep Genomic DNA Isolation Kit for Cells and Tissue), de acordo com as seguintes etapas:

1. Retirada, do “freezer” a 20 ^oC negativos, dos tubos Eppendorf com o sedimento constituído pelos linfócitos de cada amostra proveniente dos animais analisados nesse experimento.

2. Adição de 50 L de tampão de extração ao sedimento celular e homogeneização em equipamento denominado “Vortex”, até o desaparecimento dos grumos.

3. Incubação do lisado em banho-maria a 55 ^oC durante 10 minutos.

4. Adição à amostra de 800 L de tampão de aplicação e inversão do tubo várias vezes, a fim de se obter uma homogeneização adequada.

5. Incubação da amostra diluída durante 5 minutos em temperatura ambiente.

6. Preparação da coluna, conforme a seqüência a seguir:

a) Inverteu-se repetidamente a coluna para suspender completamente a resina no líquido que a contém;

b) Removeu-se o lacre inferior e a tampa da coluna, colocando-se a mesma em um tubo do tipo Eppendorf (tubo-suporte);

c) Centrifugou-se o conjunto, tubo e coluna, a 735 X g durante 1 minuto;

d) Retirou-se o conteúdo do tubo-suporte, recolocando-se o lacre inferior invertido no fundo da coluna para vedá-la.

7. Aplicação da amostra na coluna:

a) Colocou-se a metade do volume da amostra diluída (cerca de 400 L) na coluna preparada previamente, recolocando-se a tampa da mesma;

b) Para suspender a resina na amostra, inverteu-se a coluna várias vezes;

c) Manteve-se a coluna em repouso por 1 minuto, para permitir a sedimentação da resina;

d) Dispôs-se a coluna novamente no tubo-suporte, após remover-se a tampa e o fecho inferior da mesma;

e) Centrifugou-se a 735 X g durante 2 minutos;

f) Esvaziou-se o tubo-suporte e vedou-se a coluna com o fecho inferior;

g) A outra metade da amostra foi aplicada à mesma coluna, repetindo-se o procedimento anterior (letras “a” a “f”).

8. Lavagem da coluna:

a) Adicionou-se à coluna 400 L de tampão de lavagem e removeu-se o fecho inferior;

b) Centrifugou-se a 735 X g durante 2 minutos;

c) Esvaziou-se o tubo-suporte e vedou-se a coluna com o fecho inferior;

d) Repetiu-se o procedimento de lavagem.

9. Eluição:

a) Substituiu-se o tubo-suporte por um tubo Eppendorf limpo;

b) Adicionou-se 200 L de tampão de eluição à coluna e removeu-se o fecho inferior;

c) Centrifugou-se a 735 X g durante 2 minutos e vedou-se a coluna com o fecho inferior;

d) Com o mesmo tubo-suporte, aplicou-se à coluna mais 200 L de tampão de eluição e removeu-se o fecho inferior;

e) Centrifugou-se a 735 X g durante 2 minutos, resultando no tubo-suporte aproximadamente 400 L de DNA eluído.

10. Precipitação do DNA:

a) Ao DNA eluído, adicionou-se 320 L de isopropanol gelado;

b) Misturou-se vigorosamente o DNA e o isopropanol, invertendo o tubo várias vezes;

c) Incubou-se em temperatura ambiente por um período de 12 horas;

d) Centrifugou-se a 16.000 X g durante 10 minutos;

e) Sendo o sedimento que contém o DNA de difícil visualização, removeu-se cuidadosamente o sobrenadante com uma micropipeta, descartando-se o mesmo;

f) Adicionou-se ao DNA 10 L de água ultrapura, permitindo um período de hidratação de 1 a 2 horas em temperatura ambiente, sem suspender o sedimento;

g) Com uma micropipeta, misturou-se suavemente a água ao DNA, até dissolvê-lo por completo. Conservou-se o DNA linfocitário das amostras de campo congelado em “freezer” a 20 ^oC negativos.

Observação: Os tampões utilizados na extração do DNA dos linfócitos foram fornecidos juntamente com o kit, sendo que o conteúdo de cada um deles foi apresentado no anexo 8, bem como a composição da resina contida na coluna.