Prevalência de animais com anticorpos anti-brucelas lisas em rebanhos leiteiros

Resultados do estudo demonstram que a população catarinense continua susceptível ao patógeno zoonótico Brucella abortus. A prevalência de fêmeas lactantes com anticorpos anti-brucelas lisas foi de 0,46% (0,27% – 0,62%), n= 1077 animais (Figura 17 A). Em 4,1% (2,48 – 5,94%) dos rebanhos comerciais para produção de leite no Oeste Catarinense (n= 98), foi detectado a presença de animais positivos para anticorpos anti-brucelas lisas (Figura 17B). A média de ocorrência de animais soropositivos em rebanhos que apresentaram a enfermidade foi de 7,75% (Figura 17C).

Figura 17 – Prevalência de animais com anticorpos anti-brucelas lisas em

rebanhos leiteiros comerciais do Oeste Catarinenses, 2015 – 2016. A – Prevalência de animais positivos. B – Frequência relativa de rebanhos positivos.

C – Percentual de animais positivos em rebanhos com a enfermidade.

Fonte: O autor.

Notas: * IC 95% para prevalência estimada usando aproximação binomial de Wilson; ** Amplitude (limite superior e inferior).

6 7 8 9 10 Média A n im ai s P o si ti vo s p o r P ro p ri e d ad e (% ) C 0,00% 0,10% 0,20% 0,30% 0,40% 0,50% 0,60% 0,70% 0,80% Prevalência (%)

Animais

Rebanhos

6 DISCUSSÃO

Métodos diagnósticos para patógenos zoonóticos aplicados à medicina veterinária são detentores de notória relevância para saúde única. No contexto do controle e erradicação de doença animal, têm o objetivo de identificar rebanhos doentes e animais infectados dentro dos rebanhos. Relacionado à segurança dos alimentos, o teste diagnóstico, precisa comprovar a ausência de patógenos alvos ou a inocuidade, seja na origem (matéria-prima), nos processos de produção (com produtos rastreados e monitorados) ou no produto final.

O leite é um dos principais produtos do agronegócio brasileiro (CEPEA, 2011; EPAGRI, 2016) e tem elevada relevância social, além de ser um dos produtos de maior importância para a alimentação humana no país (GUIMARÃES; LANGONI, 2010). No entanto, aproximadamente 33% da produção anual de leite não sofre pasteurização (INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2012; ZOCCAL, 2012). Além disso, inexiste um monitoramento de patógenos zoonóticos na cadeia láctea e há uma escassez de informações epidemiológicas, tanto na saúde pública quanto na defesa sanitária animal, nos vários níveis geopolíticos (SANTANA et al., 2010). O controle de patógenos zoonóticos é indispensável para segurança dos alimentos e competitividade dos produtos da cadeia láctea nacional, mas os métodos atualmente disponíveis são laboriosos, demorados e pouco eficientes (CHIANG et al., 2012; CREMONESI et al., 2005; GASANOV; HUGHES; HANSBRO, 2005; KIM, H. W. et al., 2010; TAPONEN et al., 2009). Neste contexto foi idealizado um método diagnóstico, visando identificar os principais patógenos responsáveis por elevadas perdas produtivas e suprir a necessidade de biosseguridade do leite como alimento, com o intuito de possibilitar a competitividade econômica e sanitária do leite brasileiro.

Informações diagnósticas confiáveis são imprescindíveis para a realização de avaliações e intervenções relevantes, possibilitando tomadas de decisões adequadas em saúde pública, agronegócios, tramites de comércio internacional, segurança dos alimentos e no desenvolvimento de novas tecnologias e formas de tratamentos. A credibilidade atribuída aos resultados obtidos a partir dos ensaios laboratoriais é diretamente dependente da validação do método utilizado (DINIZ, 2013).

A Organização Mundial do Comércio (OMC) reconheceu três organizações internacionais como órgãos competentes para a definição de normas: a Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), reconhecida

como referência em padrões de saúde animal; a Comissão do Codex Alimentarius (Codex), órgão da Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO); e a Organização Mundial da Saúde (OMS), que elabora normas para a segurança dos alimentos e saúde pública (WIEGERS, 2002). Conforme exposto, a validação do método diagnóstico desenvolvido neste estudo seguiu as orientações do Manual de Testes Diagnósticos e Vacinas para Animais Terrestres da OIE, que segundo Diniz (2013) é a organização que apresenta o maior número de critérios de validação de métodos, o que geraria uma maior aceitação internacional do ensaio a ser validado. A consulta de tal documento, em associação a artigos científicos especializados, gera um sinergismo e tende a potencializar a validação do ensaio diagnóstico (DINIZ, 2013).

A biologia molecular vem sendo amplamente utilizada em estudos epidemiológicos de enfermidades infectocontagiosas de caráter zoonótico (LAW et al., 2015; PAULA et al., 2015; ZADOKS et al., 2011). O desenvolvimento de novos métodos moleculares para uso em medicina humana tem facilitado e oportunizado estudos destes microrganismos em animais e alimentos de origem animal. Os métodos genotípicos têm substituído com êxito os métodos fenotípicos que apresentam limitada confiabilidade e são baseados em características instáveis dos microrganismos (CHIANG et al., 2008; CHIANG et al., 2012; LEE, K. H. et al., 2008; MEIRI-BENDEK et al., 2002; SILVA, E. R.; SILVA, 2005; ZHAO et al., 2014; ZSCHOCK et al., 2005). Dentre as metodologias moleculares mais utilizadas, as tecnologias baseadas na PCR, têm revolucionado o diagnóstico das enfermidades infecciosas, por apresentar vantagens como rapidez, sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade, possibilidade de detectar patógenos fastidiosos ou não cultiváveis nos testes convencionais e uso de vários moldes não infecciosos como material de partida. Também, são rentáveis e apresentam potencialidade para automação, de modo que são ideais para se obter alto rendimento no diagnostico laboratorial, fato indispensável ao se tratar da cadeia láctea devido ao volume potencial de amostras (OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES, 2012).

O método baseado na PCR já mostrou ser uma ferramenta útil para resolução de etiologias bacteriana em amostras de leite bovino (FORSMAN; TILSALA-TIMISJARVI; ALATOSSAVA, 1997; GILLESPIE; OLIVER, 2005; NING et al., 2012; PHUEKTES; MANSELL; BROWNING, 2001; SHOME et al., 2011) e na detecção de agentes patogênicos de origem alimentar (CHIANG et al., 2012; CREMONESI et al., 2005; HOFFMANN et al., 2014; KIM, J. H. et al.,

2014). A especificidade da PCR depende da fidelidade dos iniciadores utilizados, já a sensibilidade depende das condições da reação, da pureza e da quantidade de DNA (TAMARAPU; MCKILLIP; DRAKE, 2001). A maximização destas características foi buscada no desenvolvimento de um sistema de detecção de patógenos zoonóticos em leite bovino baseado em PCR multiplex.

O sistema analítico idealizado, que tem como base a técnica de mPCR, propõem um conjunto de seis pares de iniciadores (descritos na Tabela 2), para detecção de seis patógenos (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Streptococcus agalactiae e Brucella abortus), de importância para saúde pública devido ao potencial zoonótico e, englobando os principais microrganismos causadores de mastite bovina responsáveis por prejuízos consideráveis ao agronegócio do leite. Os pares de iniciadores escolhidos e/ou desenhados mostraram capacidade de distinguir os microrganismos alvo (Figura 5), apresentaram excelente limite de detecção individual na PCR variando entre 10pg e 1fg de DNA genômico conforme o agente (Figura 6) e foram altamente específicos na identificação dos alvos patogênicos, conforme confirmação por sequenciamento dos produtos gerados. Estes resultados de apropriada especificidade e capacidade de detecção dos iniciadores, foram iguais ou superiores aos relatados na literatura por outros autores em pesquisas de detecção simultânea de patógenos em leite, usando PCR multiplex (CHIANG et al., 2012; KIM, J. H. et al., 2014; OMICCIOLI et al., 2009; PHUEKTES; MANSELL; BROWNING, 2001). Salienta-se que o processo de identificação ou desenho dos iniciadores é um dos principais fatores limitantes para a eficiência da técnica.

O sistema analítico proposto consiste em cinco etapas principais, a saber: (1) concentração da amostra pré-inoculação; (2) enriquecimento preliminar da amostra; (3) extração térmica do material genético da amostra; (4) amplificação por mPCR e (5) detecção por eletroforese em gel de poliacrilamida das sequencias amplificadas.

Na padronização da mPCR, as concentrações de iniciadores foram determinadas para alcançar a melhor eficiência de amplificação sem competição. Outros fatores críticos como concentração de Taq DNA polimerase, tempo e temperatura de ciclagem, concentração de DNA molde e adição de aditivos, foram otimizados seguindo orientações de Henegariu et al. (1997), Loffert et al.(1999) e Markoulatos, Siafakas e Moncany (2002), proporcionando um teste robusto e reprodutível, capaz de detectar os seis patógenos alvos individual ou simultaneamente ou em diferentes arranjos, isto é: quantidades diferentes dos patógenos (Figuras 9 e 10). Não foi encontrado descrição na literatura nem em base de dados

de patentes de outro teste diagnóstico com a mesma configuração de patógenos.

Os aditivos são substâncias conhecidas por terem efeitos benéficos nas reações de amplificação, mas é impossível prever qual substancia será útil num contexto particular e, portanto, devem ser testados empiricamente para cada reação. O DMSO é útil para reduzir estruturas secundárias e na amplificação de DNA rico em CG (JENSEN; FUKUSHIMA; DAVIS, 2010; SEIFI et al., 2012), quando usado em concentração final entre 2% a 10%, sendo que a concentração de 10% pode reduzir em 50% a atividade da Taq polimerase (GELFAND, 1989). Com atuação semelhante, a betaína base da maioria dos aditivos comerciais, inclusive do Q-Solution (Qiagen) como demostrado por Frackman et al. (1998), geralmente é usada na concentração de 1,0 a 1,7 M (SEIFI et al., 2012). A formamida é indicada para melhorar a eficiência da PCR em concentrações que variam de 1% a 5% (SARKAR; KAPELNER; SOMMER, 1990). O BSA 5% é descrito como aditivo útil na amplificação de DNA quando a amostra possui inibidores da PCR, como no caso do leite. No presente estudo foram testados cinco aditivos (Solução-Q® _{(betaína), formamida 1,25%, DMSO 5%, glicerol 5% e BSA} 5%), mas o melhor resultado foi obtido com a formamida 1,25%, conforme mostrado na Figura 8.

A formamida foi então testada em diferentes concentrações (1,25%, 2,5%, 5%, e 10), pois segundo Gelfand (1989) até a concentração de 10% não afeta a atividade da Taq polimerase. A concentração de 1,25% foi a que apresentou os melhores resultados com amplificação de todos os patógenos alvos na mPCR. Em nossas condições experimentais, concentrações de 2,5% e 5% inibiram parcialmente a reação e 10% inibiu totalmente a atividade da Taq DNA polimerase (resultados não apresentado), corroborando com o relatado por Sarkar, Kapelner e Sommer (1990).

De acordo com os resultados da PCR multiplex, para caracterização analítica do método, executada com diluição seriada do DNA genômico, verificou-se que a concentração mínima do DNA necessário para a reação variou de 100 fg.µL-1 _{a 1 fg.µL}-1 _{conforme o alvo} (Figura 11). As concentrações necessárias para amplificação foram inferiores às requeridas em estudos anteriores (KIM, J. H. et al., 2014; ORZIL et al., 2016; PHUEKTES; MANSELL; BROWNING, 2001; TROCANTELLI et al., 2015; YANG et al., 2013) e semelhante à observada por Shome et al. (2011), que foi de 10 fg de DNA genômico. No presente estudo, ao compararmos os limiares inferiores de detecção

dos iniciadores, mostrados pela PCR convencional com os obtidos na mPCR, verificamos que a sensibilidade foi idêntica nas duas técnicas para detecção de S. aureus e L. monocytogenes, para B. abortus e Salmonella spp. apresentou a redução de um log (1 fg para 10 fg e 10 fg para 100 fg, respectivamente) e para S. agalactiae e E. coli observamos um aumento na sensibilidade dos iniciadores quando usados na mPCR (Figuras 6 e 11).

A caracterização analítica do teste desenvolvido, mostrou limite de detecção de 100 _CFU.mL-1 _{em leite para as espécies avaliadas, exceto para} B. abortus para o qual o limite de detecção em leite foi de 104 _UFC.mL-1 (Figura 13). A sensibilidade analítica do método foi superior ao padrão- ouro e a maioria dos demais ensaios bacterianos do estado da técnica até então relatados, em condições semelhantes (mPCR para diagnóstico de agentes em leite). Vários estudos envolvendo a técnica de mPCR para detecção de patógenos em leite apresentam sensibilidade máxima de 103 CFU.mL-1 _{(GANDRA et al., 2016; RAMESH et al., 2002; RIFFON et al.,} 2001; SILVA, M. A., 2008; TROCANTELLI et al., 2015).Um nível de sensibilidade entre 103 _{– 10}5_UFC.mL-1_{para a detecção de patógenos de} mastite em leite por mPCR e por biochip, foi anteriormente relatado (LEE, K. H. et al., 2008; PHUEKTES; MANSELL; BROWNING, 2001).Em outro estudo, o limite de detecção do ensaio de mPCR para a detecção de agentes patogênicos da mastite foi apresentado como sendo de 103 _{– 10}4 _CFU.mL-1 _{(GILLESPIE; OLIVER, 2005). Sensibilidade de} 104 _CFU.mL-1 _{foi reportada para identificação de genes patogênicos de E.} coli em leite e produtos lácteos (BOTTERO et al., 2004).

Shome et al, (2011), estudando patógenos da mastite em leite, utilizando um protocolo de extração comercial de DNA direto do leite, verificaram que a mPCR mostrou limites detectáveis de 102 _CFU.mL-1 para S. agalactiae e de 101 _CFU.mL-1 _{para S. aureus e E. coli, porém estes} utilizaram um protocolo de extração comercial direta do leite. Para os mesmos agentes Cressier e Bissonnette (2011), descreveram limite de detecção de 102 _CFU.mL-1 _{analisando os produtos de amplificação por} eletroforese capilar. O uso de kit comercial para extração de DNA onera o teste dificultando sua utilização, assim como a análise por eletroforese capilar. Ressalta-se que o limite de detecção de 100 _CFU.mL-1 _mostrado neste estudo, foi obtido utilizando-se um protocolo de extração por calor e sem adição de nenhum reagente, buscando-se o menor custo fixo para o teste, visando viabilizar sua utilização no cotidiano da pecuária de leite.

Estudo avaliando o potencial da um mPCR para detecção de Staphylococcus aureus e Streptococcus spp. causadores de mastite verificou sensibilidade de 106 _CFU.mL-1 _{realizando extração do DNA a}

partir do leite total pelo método de fenol-clorofórmio e 104 _CFU.mL-1 utilizando um kit comercial (PHUEKTES; MANSELL; BROWNING, 2001).Diluindo o leite em água destilada, estes autores verificaram que o limite de detecção foi de 101 _CFU.mL-1 _{e 10}2 _CFU.mL-1 _{respectivamente} e após enriquecimento da amostra em meio TSB, 37°C por 8-12 horas a sensibilidade aumentou para 100 _CFU.mL-1 _{independentemente do} método de extração.

A presença de inibidores da reação de PCR em leite foi relatada (RIFFON et al., 2001). No entanto, os inibidores exatos no leite não foram identificados (LEE, K. H. et al., 2008). Aslam, Hogan e Smith (2003), sugeriram que a gordura do leite poderia recobrir a superfície de microrganismo e dificultar sua lise. Particularmente no leite, componentes como cálcio, proteinase, gordura e proteínas do leite, principalmente a caseína formando micelas em associação com o cálcio, podem bloquear o DNA e impedir o acesso da Taq polimerase (SILVA, M. A., 2008). Neste sentido, o desenvolvimento de uma estratégia de preparação da amostra que possa capturar o DNA da bactéria patogênica no alimento em alta qualidade torna-se necessária. Uma ferramenta de baixo custo para superar inibidores de PCR presentes no leite envolve a diluição e lavagem da amostra, condição que se consegue com o enriquecimento da amostra. Lee et al. (2008) identificaram como importante e necessário um passo de enriquecimento para detecção de concentração inferior a 103 _UFC.mL-1_{. Estudo utilizando o método da} PCR para a detecção de S. agalactiaeem leite, com previa extração por fervura, mostrou que um passo de enriquecimento durante a noite aumentou a sensibilidade do ensaio em 4 logs de 104_{– 10}5_UFC.mL-1 _para 100 _UFC.mL-1 _{(MEIRI-BENDEK et al., 2002). Estes mesmos autores} utilizando a extração por fenol-clorofórmio, sem enriquecimento prévio, obtiveram um limite de detecção de 106 _UFC.mL-1. _{Em nosso estudo o} limite de detecção idêntico foi obtido em nosso trabalho quando realizada a extração por fervura sem o passo de enriquecimento, dados não mostrados. Estudo de Chiang et al., (2012) mostrou que o enriquecimento da amostra em caldo TSB por 8 horas a 37ºC, aumentou a sensibilidade de 103_{– 10}4_UFC.mL-1 _{para 10}0 _UFC.mL-1 _{de oito patógenos de origem} alimentar em leite quando utilizada a mPCR associada a hibridização em microarranjos de DNA. A inclusão de um passo prévio de enriquecimento em meio liquido (TSB) por 10 horas a 37ºC, melhorou o limite de detecção de 103 _UFC.mL-1 _{para 10}0 _UFC.mL-1 _{de três espécies de} Streptococcus envolvidos em mastite bovina incluindo S. agalactiae utilizando mPCR (CHIANG et al., 2008). No presente estudo avaliando

a curva de crescimento dos patógenos alvo, foi estabelecido 8 horas como tempo ideal para o enriquecimento da amostra no sistema proposto (Figura 14).

Embora a sensibilidade do método de extração de DNA é importante, muitos outros fatores como: tempo requerido, o custo por teste e a necessidade de reagentes específicos devem ser considerados (CREMONESI et al., 2006).No sistema de detecção proposto,o método apresentado para a extração de DNA bacteriano, precedido por uma etapa de enriquecimento, se mostrou eficiente, reprodutível, de fácil execução, não requer equipamentos sofisticados, os reagentes utilizados são economicamente acessíveis, e demanda pouca manipulação da amostra. Destaca-se na metodologia proposta a agilidade no diagnóstico que pode ser obtido em um período de 15 horas, ao passo que um exame microbiológico demanda de 48 horas a 10 dias ou mais, para obter o resultado (GASANOV; HUGHES; HANSBRO, 2005). Esta característica credencia o método proposto para utilização na rotina de detecção de patógenos no leite.

A especificidade analítica, outra característica a ser considerada na avaliação de um novo teste, segundo a OIE, definida como a capacidade de um ensaio em distinguir os agentes de interesse diante de outros agentes estreitamente relacionados (OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES, 2014a), foi de 100% para a mPCR proposta, uma vez que não ocorreu amplificação do DNA de microrganismos não alvo, apresentados na Tabela 5. Estes resultados corroboram dados de outros autores utilizando a técnica de mPCR na detecção de patógenos em leite bovino (CHIANG et al., 2012; SHOME et al., 2011).

As características analíticas do método proposto foram validadas a partir do monitoramento de todas as etapas do processo, através de um teste duplo-cego com amostras conhecidas, apresentando total compatibilidade entre as análises (Tabela 6). Além disso, não houve inibição na amplificação quando um patógeno particular estava em baixa concentração mesmo na presença de elevadas contagem bacteriana dos demais. Os resultados do experimento às cegas neutralizam o viés de aferição, segundo Oliveira Filho (2015), ressaltando a robustez da técnica e a repetibilidade intra-laboratorial do teste, uma vez que não houve variação entre os resultados das réplicas.

A não detecção de Brucella abortus em concentrações abaixo de 104 _UFC.mL-1 _{já era esperado, uma vez que a etapa de pré-} enriquecimento não afetou a sensibilidade do teste devido ao crescimento lento deste patógeno em particular (Figura 14 D). Estima-se que a concentração microbiana necessária para detecção deste patógeno pelo

método proposto, seja de aproximadamente 4,0 bactérias.µL-1 _{na reação,} uma vez que este número de bactérias foi o limite inferior de detecção observado quando utilizamos células bacterianas como molde (Figura 12). Os iniciadores Bab 311-F e Bab 311-R apresentaram alta sensibilidade, 1,0 fg e 10 fg respectivamente para PCR e mPCR e na determinação do limite de detecção em algumas repetições apresentaram detecções menores que 104 _UFC.mL-1_{. Isto explica detecções de 10}2 UFC.mL-1_{, nas amostras “E” e “M” do experimento duplo-cego (Tabela} 6). Neste contexto, possivelmente em rebanhos endêmicos para brucelose, devido à alta concentração microbiana no leite, a mPCR proposta seja capaz de detectar o agente no leite de tanques de expansão. Outro fato que reforça a hipótese foi observado ao se testar a mPCR proposta frente a leite experimentalmente contaminado apenas com B. abortus, mostrando um limite de detecção de 100 _UFC.mL-1 _{(dado não} apresentado). A literatura apresenta limites de detecção variados para identificação Brucella spp. por PCR em amostras de leite, 101 _UFC.mL-1 (LEAL-KLEVEZAS et al., 1995; ROMERO; LOPEZ-GONI, 1999), 102 UFC.mL-1 _{(SREEVATSAN et al., 2000), 10}5 _UFC.mL-1 _{(RIJPENS et al.,} 1996).

A partir dos resultados analíticos obtidos, é possível inferir que o método diagnóstico apresenta sensibilidade superior aos limites de detecção exigidos pela ANVISA e a carga bacteriana mínima necessária ao risco de infecção alimentar. Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através da resolução – RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001, os limites permissíveis de S. aureus e E. coli para maioria dos alimentos são de 103 _UFC.mL-1 _{e ausência de L. monocytogenes e} Salmonella spp. em 25 g ou mL (BRASIL, 2001). Em relação ao risco de toxinfecção alimentar o número mínimo de S. aureus capaz de produzir enterotoxinas termoestáveis em quantidade suficiente para causar intoxicação alimentar (1 µg) varia de 105 _{a 10}6 _UFC.mL-1 _(TAMARAPU; MCKILLIP; DRAKE, 2001; TRONCO, 2010). Para L. monocytogenes a dose infectante para humanos varia de 102 _{a 10}3 _{UFC (MAĆKIW et al.,} 2016) reiterando a capacidade de detecção segura da metodologia. De acordo com a Federação Internacional de Laticínios (FIL), o leite cru é considerado “hígido” quando, no ato de sua coleta ou no momento de sua utilização artesanal, atenda às seguintes exigências: microbiota total ≤100.000 UFC.mL-1_{; células somáticas ≤300.000 UFC.mL}-1_{; S. aureus} ≤1.000 UFC.mL-1_{; E. coli ≤1.000 UFC.mL}-1_{; Salmonella ausente em} 1000 mL e Streptococcus β ausência em 0,1 mL (TRONCO, 2010).

A conveniência e praticidade na amostragem do leite, evitando os transtornos causados pela coleta de sangue ou tecidos, o estresse aos animais e consequentemente a redução das perdas desnecessárias aos produtores e empresas de laticínios é uma das vantagens do método proposto.

A redução do risco biológico aos laboratoristas é outro benefício do teste uma vez que a técnica molecular reduz o tempo de contato com o microrganismo viável, fato considerado importante quando falamos de patógenos com potencial zoonótico (OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES, 2012; ORZIL et al., 2016; YU; NIELSEN, 2010).

O custo de realização da técnica de mPCR foi definido considerando a capacidade instalada no Laboratório de Protozoologia CCB/UFSC, utilizando-se o método de custeio direto, com base no protocolo da técnica (BRUGNANO et al., 2014; SCHOEPS, 1992). Considerou-se no cálculo mão de obra, depreciação de equipamentos e instalações e impostos, baseados em custos reais para realização de uma análise por PCR de um laboratório veterinário, insumos (materiais) contabilizados com base no protocolo da técnica e perdas definidas a