Procedimento de biologia molecular

O fragmento tumoral armazenado em tubo de polipropileno de 15 ml contendo solução estabilizadora de RNA - RNAlater foi cortado manualmente com uma navalha no tamanho de 100 mg e inserido em um tubo de polipropileno de 50 ml já contendo 1ml do reagente Trizol. O fragmento foi triturado com macerador (Politron®), em seguida, mais 1 ml de Trizol foi adicionado ao tubo, o resultado final de 2 ml do reagente Trizol com o fragmento tumoral triturado foi dividido em dois tubos eppendorfs (1 ml em cada tubo). Posteriormente, adicionou-se 0,2 ml de clorofórmio para cada 1 ml de Trizol, homogeneizando por inversão e mantendo a temperatura ambiente por 3 minutos; após centrifugação a 12.000g por 15 minutos a 4ºC, a fase aquosa foi transferida para um tubo novo contendo 0,4 ml de álcool isopropílico. Após 15 minutos a temperatura ambiente, a amostra foi submetida a centrifugação por 15 minutos a 12.000g a 4ºC. Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 1 ml de etanol 75%, centrifugando por 5 minutos a 7.500g a 4ºC e descartando novamente o sobrenadante. Os tubos foram deixados sobre papel para escorrer até secar o pellet. Após esta etapa, adicionou-se 30µl de água DEPC (Amersham“

) para diluir o pellet de RNA. A integridade e qualidade do RNA extraído foram analisadas através da concentração de absorbância no Nanodrop 2000C (Thermo Scientific®) a 260nm e 280nm.

6.2. Obtenção do cDNA

A obtenção do cDNA (DNA complementar), foi realizada pela técnica de RT- PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction). Utilizou-se o Kit High Capacity cDNA (Applied Biosystems), calculando-se a quantidade dos reagentes conforme o número de amostras, sempre incluindo o volume referente às perdas que podem ocorrer durante a transferência dos reagentes.

Para cada amostra foram adicionados 10 µL de RNA na concentração de 1µg/µL e 10 µL de Mix, obtendo-se uma solução com volume final de 20 µL e concentração final de 100 ng de RNA. Estas foram colocadas no termociclador a 25ºC por 10 minutos; 37ºC por 120 minutos e 4ºC.

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6.3. Técnica de PCR quantitativo (q-PCR): análise da expressão gênica

A técnica de PCR quantitativa (qPCR) foi realizada de acordo com Bustin et al. 2009.

A reação de qPCR foi realizada em triplicata usando o método StepOne Plus Real Time PCR (Applied Biosystems) e TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems), utilizando-se os iniciadores específicos para os genes responsáveis pela síntese do MT1 e MT2. Os genes normalizadores RPS19 e RPL8 foram utilizados como controles endógenos da reação, pois mostraram menor variação de amplificação entre amostras de tecido mamário neoplásico e normal, no qual foram testados também os genes HPRT1 e RPS5.

A tabela 4 mostra as sequências dos oligonucleotídeos iniciadores.

Tabela 4: Sequência dos oligonucleotídeos utilizados na técnica de PCR quantitativo

para avaliar a expressão gênica relativa.

Gene Sequência

MT1 Sense 5’- GGACTTGCACGACTAA - 3’ Antisence - 3’ CCGTACGTCAATTGAC - 5’ Sonda Probe 5’ - TTCGAACTGATCAT - 3’

MT2 Sense 5´- GGACTTGCACGACTAA - 3´ Antisense 5´- CCGTACGTCAATTGAC - 3´ Sonda Probe 5’ - TTCGAACTGATCAT - 3’

RPS19 Sense 5´- CCT TCC TCA AAA AGT CTG GG – 3´ Antisense 5´- GTT CTC ATC GTA GGG AGC AAG – 3’ Sonda Probe 5'- CCC TGA ATG GGT GGA C - 3'

RPL8 Sense 5´- CCA TGA ATC CTG TGG AGC -3’ Antisense 5´- GTA GAG GGT TTG CCG ATG – 3´

Um fator importante a ser considerado em experimentos de PCR quantitativo é a eficiência de amplificação do gene de interesse e dos genes normalizadores, em função da concentração de RNA utilizado. Dessa forma, é possível extrair a expressão relativa do gene de interesse a partir dos resultados obtidos. Para esta verificação, foram realizadas diluições seriadas do pool de cDNA, sendo testadas as concentrações 100

26 pmols/µg, 10 pmols/µg, 1 pmols/µg, 0,1 pmols/µg e 0,01 pmols/µg, sendo estabelecida a concentração de 100 pmol/µL.

As amostras de cDNA nas concentrações citadas foram submetidas à amplificação por PCR quantitativo, sendo o teste realizado para cada gene.

O resultado da validação da eficiência é dado por um valor chamado slope, que corresponde à inclinação da reta obtida quando se analisa a variação do Ct (Cycle threshold) dos genes de interesse e dos genes normalizadores em função do Log de

diferentes quantidades de cDNA. O Ct é o momento no qual o sistema de amplificação

começa a detectar um aumento no sinal associado ao aumento exponencial do produto de PCR na fase linear da reação. As comparações de quantidades são feitas a partir dos valores dos Ct.

Os valores do slope foram padronizados refletindo uma eficiência de amplificação entre 95% e 105%. A eficiência de amplificação dos iniciadores específicos para os genes de interesse e normalizadores foram calculadas de acordo com a equação: E=10(-1/slope).

Após a etapa de padronização, foram realizadas as análises para verificar a expressão diferencial dos genes MT1 e MT2. O valor da expressão relativa dos genes de interesse foi determinado pelo método de quantificação em relação à média dos genes normalizadores (RPS19 e RPL8) utilizados como controle endógeno. As amostras foram testadas em triplicatas e, em todos os experimentos foram utilizados tecidos normais para calibração da reação.

As reações foram realizadas no equipamento Real-Time PCR System Step One Plus (Applied Biosystems) e compreenderam uma etapa inicial de 2 minutos a 50° C, seguida por desnaturação inicial de 10 minutos a 95° C. Em seguida, o programa continuou com 40 ciclos de 15 segundos a 95° C, 1 minuto a 60° C para anelamento dos iniciadores e extensão das cadeias, seguidos de 35 segundos a 65° C para coleta do sinal.

Dessa forma, a partir dos valores do Ct de cada amostra, foram calculadas as

médias das triplicatas. Posteriormente, foi calculado o 'Ct a partir da subtração da

média obtida para a sequência de interesse por aquela do controle endógeno. Para o cálculo do ''Ct, foi utilizado tecido normal (controle) como calibrador, sendo atribuído

27 Nas amostras tumorais, o resultado do ''Ct foi calculado a partir das diferenças

dos valores de 'Ct de cada um deles em relação ao calibrador. Em seguida, foi

calculado o 2-''Ct, ou seja, o ('-'Ct)2. O valor da expressão relativa dos genes de

interesse foi determinado com auxílio do software DataAssist 3.0 (Applied Biosystem). Os genes foram classificados como subexpresso (amostras com Log10 abaixo de 0) e superexpresso (amostras com Log10 maior que 0).