Procedimento de biotransformação do bufuralol empregando fungos endofíticos

Na avaliação da biotransformação do bufuralol foram empregadas cinco espécies de fungos, as quais são apresentadas na tabela C3-1.

Tabela C3-1. Fungos endofíticos selecionados para o estudo da biotransformação

do bufuralol.

Espécie de fungo Espécie vegetal Código do

fungo

Penicillium crustosum Viguiera robusta VR4 Aspergillus fumigatus Viguiera robusta VR12 Papulaspora immersa Hotson Smallanthus sonchifolius SS13 Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.

W. Mason

Smallanthus sonchifolius SS67

Phoma sp. Tinospora cordifolia ET

O procedimento de biotransformação do bufuralol foi conduzido conforme descrito no item 3.4 do capítulo 1, alterando-se de cinco para 7 dias o tempo de incubação da biotransformação.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Separação dos estereoisômeros do bufuralol e de seus principais metabólitos empregando fases estacionárias quirais

4.1.1. Determinação dos comprimentos de onda (λ) de máxima absorção no ultravioleta

Os espectros de absorção do bufuralol e 1’-hidroxibufuralol (em metanol) apresentam duas principais bandas de absorção com picos máximos em 205 e 248 nm enquanto o 1’-oxobufuralol (em metanol) apresenta suas bandas de absorção em 230 e 273 nm (dados não apresentados). O comprimento de onda empregado na detecção durante a etapa de avaliação das colunas quirais cromatográficas foi 240 nm. Apesar de não ser a banda de maior intensidade, foi adequado para a detecção de todos os analitos nesta etapa e minimizou a influência da absorção de fundo dos modificadores e aditivos orgânicos presentes nas fases móveis avaliadas. Durante a etapa de avaliação da biotransformação empregou-se os comprimentos de onda de máxima absorção no UV dos analitos, ou seja, 248 nm para o bufuralol e 1’- hidroxibufuralol e 273 nm para o 1’-oxobufuralol.

4.1.2. Otimização da separação quiral cromatográfica

O bufuralol e seus metabólitos 1’-oxobufuralol e 1’-hidroxibufuralol são substâncias de polaridade média; seus logs de P são respectivamente, 3,37; 1,83 e 1,55 (valores obtidos do programa de computador Scifinder scholar da ACD/Labs, Toronto, ON, Canadá, versão 2007). Essas características permitem o emprego do modo normal e polar orgânico de eluição.

O bufuralol (pKa 8,97), 1’-oxobufuralol (pKa 8,87) e 1’-hidroxibufuralol (8,92) são substâncias de caráter básico (valores obtidos do programa de computador Scifinder scholar da ACD/Labs, Toronto, ON, Canadá, versão 2007), dessa forma, os experimentos conduzidos no modo polar orgânico e fase normal foram realizados na presença de aditivos alcalinos.

4.1.2.1. Coluna Chirobiotic V

A coluna Chirobiotic V foi empregada por Hefnawy, Sultan e Al-Sheri (2007) na determinação enantiosseletiva do bufuralol empregando modo de eluição polar orgânico. Ciente dessa informação, a coluna foi avaliada buscando a enantiosseparação simultânea do bufuralol e seus metabólitos 1’-oxobufuralol e 1’- hidroxibufuralol.

A coluna Chirobiotic V apresentou enantiosseletividade para o bufuralol e 1’- oxobufuralol. Porém a coluna não foi capaz de separar os quatro estereoisômeros do 1’-hidroxibufuralol e, além disso, este analito coeluiu com os enantiômeros do bufuralol. A melhor separação obtida com essa coluna (Figura C3-3) ocorreu nas seguintes condições cromatográficas: Fase móvel: metanol:trietilamina:ácido acético (100: 0,1: 0,1, v/v/v), vazão de 0,5 mL min-1 _{e detecção em 240 nm.}

Figura C3-3. Melhor separação dos estereoisômeros do bufuralol, 1’-oxobufuralol e

1’-hidroxibufuralol na coluna Chirobiotic V. Picos 1 e 2: enantiômeros do bufuralol; picos 3 e 4: 1’-hidroxibufuralol; picos 5 e 6: enantiômeros do 1’-oxobufuralol. Fase móvel constituída por metanol: trietilamina: ácido acético (100: 0,1: 0,1, v/v/v), vazão de 0,5 mL min-1 _{e detecção em 240 nm.}

Narimatsu et al. (2002) desenvolveram um método estereosseletivo para a determinação simultânea de bufuralol e um de seus metabólitos 1’-hidroxibufuralol empregando a coluna Chiralcel OD (partículas de 10 µm) e fase móvel composta por hexano : etanol : dietilamina (95:5:0,1; v/v/v). Esta condição foi avaliada e não foi observada a separação dos enantiômeros do 1’-oxobufuralol.

Usando este mesmo seletor quiral, porém com tamanho de partículas de 5 µm, e fase móvel constituída por hexano:isopropanol:metanol (97,5:2,0:0,5; v/v/v) acrescidos de 0,5% de dietilamina, vazão de 1,5 mL min-1 _{e detecção em 240 nm, foi}

possível obter a separação simultânea desses analitos, inclusive do 1`-oxobufuralol. A condição de separação otimizada dos estereoisômeros do bufuralol e seus metabólitos empregando a coluna Chiralcel OD-H pode ser observada na Figura

C3-4.

Figura C3-4. Melhor separação dos estereoisômeros do bufuralol e seus metabólitos

na coluna Chiralcel OD-H. As condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel composta por hexano:isopropanol:metanol (97,5:2,0:0,5; v/v/v) + 0,5% de DEA, vazão de 1,5 mL min-1 e detecção em 240 nm. (1) (R)-bufuralol, (2) (S)- bufuralol, (3) (R)-1’-oxobufuralol, (4) (S)-1’-oxobufuralol, (5) (R,R) 1’-hidroxibufuralol, (6) (S,R) 1’-hidroxibufuralol, (7) (R,S) 1’-hidroxibufuralol e (8) (S,S) 1’- hidroxibufuralol.

A Tabela C3-2 apresenta algumas características de desempenho do método otimizado.

Tabela C3-2. Parâmetros de desempenho do método cromatográfico nas condições

otimizadas.

Picos Tempo de

retenção (min) Resolução

Fator de retenção (k) Número de pratos (N) (R)-Bufuralol 2,7 --- 1,30 2381 (S)-Bufuralol 4,0 4,64 2,35 2596 (R)-1’-Oxobufuralol 4,7 1,88 2,91 2267 (S)-1’-Oxobufuralol 5,2 1,10 3,30 2152 (R,R)-1’-Hidroxibufuralol 8,0 4,82 5,66 1917 (S,R)-1’-Hidroxibufuralol 9,3 1,71 6,76 2077 (R,S)-1’-Hidroxibufuralol 11,3 2,25 8,45 2115 (S,S)-1’-Hidroxibufuralol 15,6 3,75 12,04 2297

A resolução, número de pratos e fator de retenção foram calculados com auxílio do software LCsolution® versão 1.22 SP1. Para o cálculo da Rs o software emprega a seguinte equação: Rs = 2(tR2 – tR1) / wb2 + wb1, onde tR2 é o tempo de retenção do pico mais retido e tR1 do pico menos retido.

wb2 e wb1 são as respectivas larguras das bases dos picos na linha da base, calculadas pelo método

da tangente. No cálculo do N o software emprega a seguinte equação: N = 16(tR/ wb)2, onde tR é o

tempo de retenção do pico e wb é a largura do pico na linha da base. O cálculo do fator de retenção é

realizado pelo software empregando a seguinte equação: k = (tR - tM) / tM, onde tR é o tempo de

retenção do analito e tM é o tempo necessário para as moléculas da fase móvel percorrerem a coluna

ou tempo de “volume morto” (SNYDER; KIRKLAND; GLAJCH, 1997).

A ordem de eluição foi estabelecida pela análise dos estereoisômeros puros do bufuralol, 1’-oxobufuralol e 1’-hidroxibufuralol obtidos através da análise semipreparativa de seus racematos na coluna Chiralcel OD-H nas condições descritas no item “4.1.2.2. Coluna Chiralcel OD-H” deste capítulo. Posteriormente, os estereisômeros coletados do bufuralol e 1’-hidroxibufuralol foram analisados isoladamente em uma coluna Chiralcel OD (25 x 4,6 mm, 10 µm) usando hexano:etanol:dietilamina (95:5:0,1; v/v/v) como fase móvel, de acordo com método descrito por Narimatsu et al. (2002). Então, os tempos de retenção dos estereoisômeros do bufuralol e 1’-hidroxibufuralol foram comparados e a ordem de eluição determinada. A ordem de eluição para os enantiômeros do 1’-oxobufuralol foi determinada pela obtenção de espectros de dicroísmo circular dos enantiômeros puros do bufuralol e 1’-oxobufuralol na faixa de 190 a 400 nm usando um espectropolarímetro modelo J-810, equipado com aparelho de controle interno de temperatura modelo PTC-423S, ambos da marca Jasco (Easton, PA, EUA), usando uma cubeta de quartzo com 1,0 cm de caminho óptico e temperatura de 25°C. Em todas as análises foi realizada a subtração do ruído da linha de base (solvente onde estão diluídos os enantiômeros). As condições de varredura empregadas foram as

seguintes: modo contínuo na taxa de 200 nm min-1_{, largura da banda espectral de 1}

nm e resposta de 0,5 s. O enantiômero do 1’-oxobufuralol que apresentou o mesmo efeito “cotton” do (R)-bufuralol foi considerado (R) e o que apresentou o mesmo efeito “cotton” do (S)-bufuralol foi considerado (S).

O uso de diferentes fases móveis com um mesmo seletor quiral derivado de polissacarídeo pode resultar em inversão da ordem de eluição (OKAMOTO, 2002; MA et al., 2009), porém isso não foi observado neste estudo. A ordem de eluição dos enantiômeros do bufuralol e estereoisômeros do 1’-hidroxibufuralol no método apresentado neste capítulo foi a mesma observada no método descrito por Narimatsu et al. (2002). O pico 1 (Figura C3-4) corresponde a (R)-bufuralol, pico 2 a (S)-bufuralol, pico 5 a (R,R)-1’-hidroxibufuralol, pico 6 a (S,R)- 1’-hidroxibufuralol, pico 7 a (R,S)- 1’-hidroxibufuralol e pico 8 a (S,S)- 1’-hidroxibufuralol.

A ordem de eluição dos enantiômeros do 1’-oxobufuralol não está descrita na literatura. Devido a isso, a combinação de métodos cromatográficos e dicroísmo circular pode ser usada para a determinação da configuração absoluta de análogos estruturais (LÄMMERHOFER et al., 2010), que é o caso do 1’-oxobufuralol em relação ao bufuralol. Dessa forma, foi realizada a comparação dos espectros de dicroísmo circular dos enantiômeros do bufuralol e 1’-oxobufuralol e foi observado que o primeiro enantiômero eluído do 1’-oxobufuralol (Figura C3-4) apresentou efeito “cotton” semelhante ao (R)-bufuralol e foi considerado (R)-1’-oxobufuralol (pico 3) e o segundo enantiômero eluído apresentou efeito “cotton” semelhante ao (S)- bufuralol e foi considerado (S)-1-oxobufuralol (pico 4).

4.2. Otimização da microextração em fase líquida empregando membranas