Procedimento e Aspetos Técnicos da Microinjeção

O procedimento inicial para a ICSI é bastante semelhante ao descrito para a FIV, com algumas etapas em comum: estimulação ovárica controlada seguida de punção folicular e triagem dos CCO (Pimentel e Plancha, 2014). Nesta técnica, contudo, os ovócitos têm de ser desnudados (secção 3.7.) de modo a permitir a avaliação da maturidade nuclear e da qualidade ovocitária bem como uma melhor visualização e manuseamento do ovócito durante a microinjeção (De Vos, 2000; Van Steirteghem, 2007). Este processo é realizado, pelo menos, 3h após a punção folicular (Mansour, 1998). Relativamente aos gâmetas masculinos, estes são colhidos e preparados pelos métodos descritos nas secções 3.2. e 3.3., respetivamente. Uma alíquota da amostra é observada para confirmação da concentração, motilidade e morfologia (De Vos e Van Steirteghem, 2005). Nos casos em que apenas estão disponíveis espermatozoides imóveis, é importante selecionar aqueles que são viáveis recorrendo ao teste de hipoosmolaridade (De Vos, 2000).

A placa de microinjeção é preparada cerca de 20 a 30 minutos antes da sua utilização, de acordo com a figura 30 (Elder e Dale, 2011). Na região mais à direita da placa de Petri colocam-se pequenas gotas de meio tamponado (cerca de 5 µl) previamente aquecido a 37°C. Na região da esquerda colocam-se 2 gotas de meio PVP20 (aproximadamente 10 µl), que se espalham na placa com a ajuda da ponta da micropipeta, formando duas linhas lado a lado. Após a sua preparação, a placa é coberta de imediato com óleo, de modo a evitar a evaporação das gotas e a manter as condições ótimas aquando da micromanipulação, e colocada na estufa a 37°C até à sua utilização (Elder e Dale, 2011). Momentos antes da microinjeção, os gâmetas são adicionados à placa. Uma alíquota – cujo volume é dependente da concentração – dos espermatozoides preparados é colocada na periferia da primeira gota de PVP, enquanto os ovócitos em MII são colocados individualmente nas gotas de meio tamponado (Mansour, 1998).

Após todo este processo de preparação, a placa de ICSI é colocada na platina do microscópio, que se encontra a 37°C, para se iniciar a microinjeção. Os micromanipuladores mecânicos são utilizados para descer as micropipetas previamente focadas (Elder e Dale, 2011). A pipeta de microinjeção é baixada para a gota mais periférica de PVP, sendo esta focada. É, então, selecionado e aspirado um espermatozoide de acordo com a sua morfologia (Mansour, 1998). Esse

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O PVP é uma solução viscosa usada para reduzir a motilidade dos espermatozoides, facilitando a sua manipulação (Elder e Dale, 2011). Previne também a adesão dos espermatozoides à pipeta (Mansour, 1998).

espermatozoide é transferido para a gota adjacente de PVP, onde é colocado numa posição perpendicular relativamente à pipeta de microinjeção, facilitando a sua imobilização. A imobilização envolve o esmagamento da cauda do espermatozoide – na zona abaixo da peça intermédia – entre a pipeta e o fundo da placa de Petri através de um golpe seco (De Vos e Van Steirteghem, 2005). Este passo provoca danos na membrana citoplasmática do espermatozoide, com a consequente libertação de fatores citosólicos bastante importantes na ativação do ovócito, o que se traduz no melhoramento das taxas de fertilização. Se, durante a imobilização, a cauda for danificada ou torcida, o espermatozoide deve ser descartado e o procedimento repetido com outro espermatozoide (Neri et al., 2012).

Fig. 30 – Representação esquemática da placa de microinjeção. (a) Vista superior: as gotas de PVP espalhadas, onde serão colocados os espermatozoides, situam-se à esquerda, enquanto as gotas de meio tamponado, onde serão colocados os ovócitos, encontram-se à direita; (b) Vista frontal: gotas de PVP e de meio tamponado cobertas pelo óleo, responsável pela manutenção das condições de temperatura durante a microinjeção.

O espermatozoide imobilizado é aspirado pela cauda e posicionado na extremidade da pipeta ICSI, imediatamente colocada sobre a gota do ovócito a microinjetar (Elder e Dale, 2011). O ovócito é posicionado com o GP às 6 ou às 12 horas e fixado através de uma ligeira sucção por parte da pipeta holding. Esta localização específica do GP permite minimizar a possibilidade de danos no fuso meiótico (De Vos e Van Steirteghem, 2005).

Antes da microinjeção, a pipeta ICSI é aproximada do ovócito e posicionada às 3 horas, sendo importante confirmar que o plano equatorial do ovócito, a abertura interna da pipeta holding e a extremidade da pipeta ICSI se encontram no mesmo plano de focagem (Figura 31a). Esta última é, então, empurrada muito lentamente de modo a perfurar a ZP e a membrana citoplasmática do ovócito, que oferece alguma resistência (Mansour, 1998). Normalmente, a rotura da membrana ocorre quando a pipeta atinge o centro do ovócito (Figura 31b) (Neri et al., 2012). Após a pipeta atingir a superfície interna da membrana às 9 horas, aspira-se lentamente uma pequena quantidade de citoplasma que é novamente injetada no ovócito juntamente com o

espermatozoide, promovendo a ativação do ovócito e a miscigenação do gâmeta masculino com os organelos do citoplasma (Palermo et al., 2012b). O procedimento termina com a retirada lenta da pipeta ICSI – para evitar a saída do espermatozoide – e a libertação do ovócito da pipeta holding (Figura 31c). Todo este processo é repetido até que todos os ovócitos maduros tenham sido microinjetados (Elder e Dale, 2011).

Após terminada a microinjeção de todos os ovócitos, sobem-se as pipetas e a placa de Petri é colocada na câmara de fluxo laminar de superfície aquecida. Numa placa de 4 poços previamente preparada, procede-se à lavagem dos ovócitos e à sua colocação em meio de cultura. A placa é incubada overnight a 37°C, 6% de CO2 e 5%

de O2 (Elder e Dale, 2011). Tal como na FIV, cerca de 17 1 horas, é avaliado o

resultado da fertilização pela presença dos dois pró-nucleos e pela extrusão do 2º GP (Alpha SiRM e ESHRE SIGE, 2011). Os pré-zigotos são novamente colocados em cultura nas mesmas condições anteriores até ao momento da transferência.

As taxas de insucesso na ICSI variam entre 1 a 3% quando é microinjetado um baixo número de ovócitos. Estas falhas podem dever-se a uma combinação de falha da fertilização, fertilização anormal (com 1 ou 3 PN) ou degeneração do ovócito. Mais raramente, a fertilização pode falhar com um número adequado de ovócitos e de espermatozoides devido à ausência de sincronismo entre a maturação nuclear e citoplasmática do ovócito e também à morfologia dos espermatozoides (Palermo et al., 2015). As taxas de gravidez são negativamente relacionadas com a idade materna, que prejudica a qualidade dos ovócitos e/ou dos embriões (Neri et al., 2012). Apesar de tudo, a ICSI resulta na produção de um grande número de embriões com altas taxas de implantação, que culminam no nascimento de milhares de crianças em todo o mundo (Elder e Dale, 2011).

Fig. 31 – Processo de microinjeção. De notar a posição do GP às 12h. (a) Antes da entrada no ovócito, o espermatozoide é aproximado da abertura da pipeta de microinjeção; (b) Quando a pipeta de microinjeção atinge o centro do ovócito, observa-se a rotura da membrana plasmática do ovócito. O espermatozoide é depositado junto à superfície interna da membrana do ovócito (às 9 horas); (c) Após a retirada da pipeta, é observada a rotura da membrana plasmática do ovócito, em forma de cone com o vértice no centro do ovócito. Adaptado de Neri et al. (2012).