Procedimento Experimental para o Crescimento da C acetobutylicum Com Diferentes Substratos

Pan et al. (2008) estudaram um meio de cultura ótimo para a produção de hidrogênio por Clostridium sp. Fanp2, identificando os fatores determinantes pelo método de triagem de Plackett–Burman. Tais

64

fatores foram glicose, tampão fosfato e solução vitamínica, todos com influência individual significativa e sinergia entre glicose e os outros dois fatores. Devido ao grande número de reagentes necessários aos meios de Pan et al. (2008), optou-se por meios mais simples (Tabela 4 e Tabela 5), indicados pela Fundação André Toselo, a fornecedora da C. acetobutylicum ATCC 824.

O crescimento consiste inicialmente de uma reativação em um meio clostridial reforçado (Reinforced Clostridial Medium - RCM) previamente autoclavado a 121 °C/15 min. A reativação deve ser feita durante 24 horas em jarro de anaerobiose a 37 °C e pH 6,8, aqui chamada de pré-cultura. A transferência das bactérias para o meio RCM é feita em capela de fluxo laminar previamente esterilizada com álcool 70 % e luz UV. O procedimento de inoculação do meio RCM é feito próximo a chama de um bico de Bunsen. A tampa do frasco deve estar praticamente solta e o mesmo deve ser colocado no jarro de anaerobiose juntamente com um sachet do produto Anaerogen da Oxoid, que garantirá a anaerobiose do jarro.

Tabela 4 – Meio clostridial reforçado (RCM) para a pré-cultura.

Composto Concentração (g/L) Glicose-D 5,0 Peptona 10,0 Cloreto de sódio 5,0 Amido solúvel 1,0 Extrato de levedura 3,0 Extrato de carne 10,0

Cloridrato de cisteína (1-hidr) 0,5

Acetato de sódio 3,0

Fonte: Fundação André Tosello

Após 24 horas de reativação, o resultado é o mostrado na Figura 6.

65

Figura 6 – Meio RCM após a reativação.

Fonte: Do autor.

Um novo meio, agora destinado a fermentação propriamente dita, é então inoculado a 10 % v/v utilizando o meio RCM com as bactérias reativadas. A inoculação do meio de fermentação, previamente autoclavado, também é feita em capela de fluxo laminar com os mesmos cuidados de esterilização do meio RCM.

Tabela 5 – Meio de fermentação.

Composto Concentração (g/L) Glicose-D 20,0 Peptona 4,0 Cloreto de sódio 3,0 Extrato de levedura 1,0 Extrato de carne 1,0

Cloridrato de cisteína (1-hidr) 0,5

Acetato de sódio 0,1

Fonte: Fundação André Tosello

Após a inoculação, os frascos foram tampados com rolhas de silicone contendo dois tubos de vidro seguidos de mangueiras de silicone para entrada e saída de gases devidamente seladas com pinças de mohr. Foi acoplada a saída do cilindro de nitrogênio a um filtro e este a entrada de gás do frasco. Liberou-se a saída de gás do frasco e borbulhou-se o nitrogênio para remover o oxigênio no espaço de topo e manter o ambiente anaeróbio. Este procedimento leva em torno de 10 minutos. A entrada e a saída de gases do frasco foram novamente

66

seladas simultaneamente. Para todos os frascos, as saídas de gás foram acopladas a lavadores de gás contendo solução 1 M de NaOH, para a captura do CO2, e as saídas dos lavadores de gás foram finalmente acopladas a provetas invertidas, de onde foi quantificado o volume de gás restante produzido (primordialmente hidrogênio). As pinças de mohr das saídas de gás foram liberadas e as das entradas foram usadas durante todo o experimento para a retirada de amostras do meio líquido por meio de seringas. Iniciou-se a fermentação a 37 °C em um agitador orbital a 120 rpm conforme mostrado na Figura 7.

Figura 7 – Aparato experimental utilizado.

(a)

(b)

Fonte: Do autor.

O volume do gás foi determinado pelo método de proveta invertida. Devido aos lavadores de gás, considerou-se este o volume de

67

hidrogênio, o produto desejado. A concentração de células foi determinada por turbidimetria a 570 nm e também por peso seco, este último centrifugando a amostra a 10000 g por 10 minutos, lavando duas vezes com água destilada e secando a 60 °C até peso constante. A concentração de glicose, e outros açúcares nas variações de substrato, foi determinada pelo método ácido antrona-sulfúrico (DUBOIS et al., 1956). O pH do meio também foi monitorado.

O método ácido antrona-sulfúrico de Dubois et al. (1956) consiste primeiramente em preparar as curvas padrões dos substratos testados, com concentrações variando entre 10 e 70 µg/mL (0,01 e 0,07 g/L). Mistura-se 1 mL da solução com 1 mL de fenol 5% e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado em béquer. No branco substitui-se o 1 mL da solução por 1 mL de água destilada. Espera-se 10 min e faz-se a leitura da absorbância segundo a Tabela 6.

Tabela 6 – Comprimentos de onda para o método de Dubois et al. (1956).

Substrato Comprimento de onda (nm) Glicose 485

Sacarose 490 Maltose 490 Lactose 490

Para as medidas de concentração de substrato durante a fermentação, uma amostra de 1 mL é retirada do sobrenadante do procedimento de peso seco e diluída em balão de 250 mL, deixando a concentração dentro da faixa de detecção do método de Dubois et al. (1956). Novamente é misturado 1 mL da solução com 1 mL de fenol 5% e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado em béquer. O resultado de absorbância obtido é convertido em concentração pelas curvas padrões previamente construídas, finalizando com os cálculos necessários para obter a concentração original do meio à partir da concentração diluída.

O procedimento completo durou em torno de 10 horas com amostragens de hora em hora em duplicata, contados à partir da saída das primeiras bolhas de ar, para evitar o refluxo do meio básico do lavador de gás para o meio de fermentação.

Os ensaios de cada substrato testado foram feitos sempre simultaneamente com glicose (dois reatores com o substrato teste e dois com glicose), evitando assim que influências ambientais ou na preparação do meio interferissem na análise comparativa.

68

Com este procedimento, investigou-se a resposta na produção de hidrogênio quanto a utilização de outros substratos, sugeridos durante a análise de sensibilidade.