Procedimento experimental

A seguir um roteiro dos procedimentos experimentais dos testes de germinação com es- tresse químico é apresentado.

 Preparação das soluções - Soluções estressantes foram preparadas a partir de soluções padrões, tendo como base testes de sensibilidade previamente feitos para se descobrir as concentrações efetivas EC100 e EC50, ou seja, aquelas que provocam taxas de germinação de 0% e 50%. Posteriormente, o pH destas soluções foram corrigidos para próximo de 7, por ser o pH neutro, correspondendo ao pH da água destilada.

 Germinação das sementes - Sementes de trigo (Triticum aestivum) de um lote bem ca- racterizado quanto à idade e origem, foram selecionadas e agrupadas em 6 amostras com 25 sementes cada, tendo sido a massa de cada amostra medida em balança de precisão. A manipulação destas amostras se deu em ambiente higienizado, e fazendo-se uso de luvas

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de látex para evitar contaminação por microorganismos. As amostras foram então, cuida- dosamente arranjadas no interior de 6 placas de Petri de 6 cm, sobre 5 filtros de papel previamente esterilizados em autoclave, e embebidos em 3 ml de água destilada. Após a montagem destas 6 placas, elas foram rotuladas para identificação posterior e levadas a uma câmara de germinação do tipo BOD para germinar no escuro, sob controle de umida- de e temperatura constante de 20 ºC por um período inicial de 72 horas. Após este perío- do, 2 das 6 placas de Petri foram retiradas da câmara BOD, em condição de pouca ilumi- nação, uma delas recebendo 2 ml de água, aquela rotulada como “Controle 1”, e a outra 2 ml de solução estressante, rotulada “Estresse 1”, e então levadas ao interior das câmaras de medição de UWPE. Das 4 placas que permaneceram na câmara de germinação, 2 delas receberam 2 ml de solução estressante, rotuladas como “Estresse 2 e 3”, e duas receberam 2 ml de água destilada, rotuladas como “Controle 2 e 3”, germinando por mais 24 horas.

 Medições da UWPE - Dois sistemas de medição idênticos (PMT01 e PMT02), exceto pela diferença de ganho, como explicado na seção 3.3.4, e implementados segundo as descrições feitas no Capítulo 3, usando a placa de contagem USB C8855, foram usados de forma simultânea para a medição das UWPEs da placa contendo a amostra de controle e da placa contendo a amostra sob estresse. Após se proceder à esterilização das duas câma- ras com álcool 70%, as duas placas de Petri retiradas da câmara de germinação, em condi- ção de pouca iluminação, foram colocadas no interior das câmaras PMT01 e PMT02, após uma delas, rotulada como “Controle 1” receber outros 2 ml de água destilada, e a outra ro- tulada como “Estresse 1” receber mais 2 mL de solução estressante, respectivamente. De- pois de serem fechadas e os parâmetros de aquisição ajustados no programa de controle em LabVIEW para uma duração do teste de 24 horas e contagens integralizadas a cada 10 segundos, inicia-se as contagens de UWPE nas duas câmaras simultaneamente. Além dis- to, a sala onde as câmaras foram instaladas sendo climatizada, a temperatura dos ensaios permaneceu constante em cerca de 20 ºC.

 Variação do teste - Em uma variação do procedimento acima, as medições nas 2 câmaras têm início no 1º dia de germinação, simultaneamente à germinação das 4 outras amostras dentro da câmara de germinação, e por um período de inicial de 72 h. No início do 4º dia, as câmaras são abertas em condição de pouca iluminação, o agente estressante aplicado na amostra da PMT02 e água destilada aplicada na amostra da PMT01, e então fechadas para

que a aquisição continue por mais 24 h. O mesmo ocorrendo com as placas na câmara de germinação, ou seja, 2 delas recebem 2 ml de solução estressante e duas recebem 2 ml de água destilada, germinando por mais 24 horas.

 Medição dos resultados das germinações - Após o término do período de 96 horas dos testes, as 6 amostras de 25 sementes que estiveram germinando, adquiriram biomassa, es- tas foram então novamente pesadas, e os comprimentos das raízes medidos.

 Processamento dos dados - Os dados das medições das biomassas e de foto-contagem (UWPE) foram processados através do programa de tratamento de dados OriginPro ver- são 8, da empresa OriginLab Corp. Todos os gráficos da evolução temporal das UWPEs foram alisados através da média local dos 100 valores de foto-contagem adjacentes, mas- carando assim as variações aleatórias do ruído de escuro que são agregados aos sinais de biofótons.

 Diferenças nos ganhos das PMTs - Embora as duas câmaras PMT01 e PMT02 sejam i- dênticas, e equipadas com módulos PMTs do mesmo modelo (H7360), a eficiência de de- tecção do módulo da câmara PMT02 (H7360-02) sendo maior que o da PMT01 (H7360- 01), leva os valores de contagem da PMT02 serem sempre maiores que o da PMT01, para as mesmas condições de teste, embora este último apresente menor ruído de escuro. Tal fato foi corrigido no tratamento dos dados pelo programa OriginPro aplicando-se um fa- tor de correção aos dados oriundos da PMT02. Este fator de correção foi obtido calculan- do-se a média dos dados gerados pela razão entre os valores de foto-contagens obtidas das medições do ruído de escuro das PMT02 e PMT01. Esta razão entre os dados de fotocon- tagem de ruído foi calculada ponto a ponto, e o valor médio desta razão resultou em 1,20.

 Sequência de testes – Ao término de cada teste de uma série, o teste seguinte é colocado para medição na câmara de medição de UWPE. Para que esse seqüenciamento fosse pos- sível, houve a necessidade de um planejamento de montagem das placas de Petri com as amostras de modo que os inícios de germinação destas amostras.