4. MATERIAL E MÉTODOS
4.5. Procedimento histotécnico
Depois de radiografadas, as peças foram desmineralizadas em solução de Morse (ácido fórmico 25% (v/v) e citrato de sódio 10% (m/v), renovada semanalmente, como pré-requisito para o processamento histotécnico.
O processo de desmineralização dos espécimes consumiu
aproximadamente três meses, sendo monitorado por meio de exames radiográficos convencionais, nos quais eram observadas áreas radiopacas (menor desmineralização) e radiolúcidas (maior desmineralização) e pela penetração de um alfinete para verificar a consistência.
Constatada a completa desmineralização, os espécimes foram
lavados em água corrente, desidratados em série crescente de concentração de álcoois, diafanizados em xilol e incluídos em parafina. Foram processados 20 dentes no total, sendo 10 para o período de sete dias e 10 para o período de setenta dias. Dentre estes, 4 eram 1os molares inferiores, que, por serem muito grandes, foram divididos ao meio e, assim, a raiz mesial e a distal foram incluídas separadamente,
Material e Métodos 36
totalizando, desta forma, 24 blocos, após o que, foram realizados os cortes seriados de 6 µm de espessura, colorações com Hematoxilina e Eosina (H.E.) e montagem das lâminas para a realização da análise ao microscópico óptico.
4.6. Análise microscópica
Com o auxílio de um microscópio óptico Bauch & Lomb® (USA),
foram avaliados os seguintes eventos:
1. Neoformação de tecido mineralizado;
2. Características do tecido mineralizado neoformado; 3. Características do tecido pulpar remanescente; 4. Características da camada odontoblástica; 5. Resposta celular inflamatória.
Resultados 38
5. RESULTADOS
Os resultados foram obtidos por meio da análise microscópica descritiva do processo de reparo da polpa dentária e por meio da análise radiográfica digital (Digora) e convencional, após os períodos experimentais de sete e setenta dias, depois de realizada a pulpotomia em dentes de cães e proteção do remanescente pulpar com membrana absorvível de cortical óssea bovina desmineralizada (Grupo I – material teste) e com o hidróxido de cálcio (Grupo II – material controle).
5.1. Análise microscópica
5.1.1 Período de sete dias
A) Grupo I (teste) – Membrana absorvível de cortical óssea bovina desmineralizada
Os espécimes examinados demonstraram a embocadura do canal radicular fechada por uma estrutura amorfa, basofílica e homogênea, representando o material protetor (Figura 4A). O tecido conjuntivo pulpar subjacente apresentou-se em íntimo contato com a referida estrutura (Figura 4B), exibindo um aspecto frouxo e um ou outro fragmento de dentina. A camada odontoblástica da parede dentinária estava alterada (Figura 4C).
Resultados 39
A microscopia demonstrou a embocadura dos canais radiculares tomada por uma estrutura de aspecto eosinofílico e homogêneo, caracterizando uma massa disforme compatível com a necrose por coagulação (Figura 4D). Essa massa apresentou-se em contato direto com o tecido conjuntivo subjacente (Figura 4E), que apresentava fragmentos de dentina e moderado infiltrado inflamatório crônico estendendo-se, gradativamente, de modo discreto, para o tecido conjuntivo pulpar nos limites do terço cervical. A camada de células odontoblásticas estava alterada na região do terço cervical, no entanto, foi possível detectar remanescentes das referidas células posicionadas junto à camada de pré-dentina, bem como a presença, em alguns espécimes, de um foco hemorrágico nas imediações. A partir do terço médio para apical, o tecido conjuntivo pulpar exibiu características de normalidade com a camada odontoblástica bem definida (Figura 4F).
5.1.2 Período de setenta dias
A) Grupo I (teste) – Membrana absorvível de cortical óssea bovina desmineralizada
Das 11 raízes que receberam este material, apenas 2 apresentaram a embocadura do canal fechada por uma faixa estreita de tecido fibroso que se sobrepunha a um tecido neoformado de aspecto eosinofílico, compatível com tecido mineralizado (Figura 5A), que se posicionava aderido às paredes dentinárias para depois se projetar em direção à luz do canal. Este tecido
Resultados 40
mineralizado neoformado apresentava-se espesso e homogêneo em toda a extensão do canal, cujo processo de formação evoluiu da periferia para o centro, obliterando-o no terço cervical (Figura 5B). Ele encontrava-se unido ao tecido mineralizado do interior do canal (Figura 5C) que continha estruturas basofílicas sugestivas de fragmentos de dentina (Figura 5D). O tecido pulpar subjacente estava presente demonstrando, inclusive, presença de células odontoblásticas posicionadas nas paredes laterais. As demais raízes também apresentaram a embocadura dos canais fechada por estreita faixa de tecido fibroso, porém não houve formação de tecido mineralizado neoformado, e o interior dos canais estavam preenchidos por tecido conjuntivo fibroso em toda a extensão (Figura 5E). Células inflamatórias não foram observadas no remanescente do tecido conjuntivo pulpar.
B) Grupo II (controle) – Hidróxido de cálcio
A embocadura do canal radicular de todos os espécimes examinados apresentou-se fechada por um tecido mineralizado neoformado com características dentinóides, demonstrando na sua intimidade áreas homogêneas entremeadas por estruturas sugestivas de túbulos dentinários (Figura 5F). Observou- se a presença de tecido conjuntivo pulpar de aspecto predominantemente denso e rico em fibras colágenas, que continuou até o terço apical com remanescentes de tecido conjuntivo frouxo e células odontoblásticas em desarranjo estrutural.
Resultados 41
Figura 4: Fotomicrografia do remanescente de tecido pulpar protegido com membrana absorvível [A-C] e hidróxido de cálcio [D-F], no período de sete dias. Membrana absorvível em íntimo contato com o tecido conjuntivo pulpar
subjacente [ , A (H.E. 10X) e B (H.E. 40X)]; fragmento de dentina [*,
B (H.E. 40X)] e camada odontoblástica alterada [
→→
, C (H.E. 40X)]. Necrose porcoagulação, induzida pelo hidróxido de cálcio [
Æ
, D (H.E. 10X)], em contato direto com o tecido pulpar subjacente [Æ
, E (H.E. 40X)] e camada odontoblástica bem definida [→→
, F (H.E. 40X)].A
A
DD
B
B
C
C
E
E
F
F
*
Resultados 42
Figura 5: Fotomicrografia do remanescente de tecido pulpar protegido com
membrana absorvível [A-E] e hidróxido de cálcio [F], no período de setenta dias. Faixa de tecido fibroso na embocadura do canal sobrepondo o tecido
mineralizado neoformado aderido às paredes dentinárias [
→→
, A (H.E. 10X)]; tecido mineralizado neoformado obliterando o terço cervical [ , B (H.E. 10X)]; tecidomineralizado neoformado unido ao tecido mineralizado do interior do canal
[ , C (H.E. 10X)]; fragmentos de dentina [*, D (H.E. 100X)] e tecido conjuntivo
fibroso formado em toda a extensão do canal radicular [ , E (H.E. 10X)]. Tecido mineralizado neoformado na embocadura do canal radicular [
Æ
, F (H.E. 10X)].D
D
A
A
B
B
EE
*
*
C
C
FF
Resultados 43
5.2. Análise radiográfica
Os observadores analisaram os 20 dentes, totalizando 32 raízes, 16 para cada período experimental. Cada raiz foi interpretada quatro vezes (uma para cada observador).
Dentre as 32 raízes analisadas, 22 foram protegidas com membrana absorvível após a pulpotomia, entretanto, nenhuma delas apresentou imagem sugestiva de barreira mineralizada, por nenhum dos métodos radiográficos. A proteção com hidróxido de cálcio foi realizada em 10 raízes, das quais 5 apresentaram imagem sugestiva de barreira mineralizada.
A análise das imagens digitais indicou a presença de imagem sugestiva de barreira mineralizada em 4 raízes, que receberam o hidróxido de cálcio como material protetor, sendo todas referentes ao período de sete dias. Por este método, não houve concordância entre todos os observadores em qualquer das raízes (Tabela 3, Figuras 6-8). Não houve diferença entre as imagens padrão, negativa e 3D para cada raiz observada.
Em contrapartida, através da análise das radiografias convencionais, 5 raízes apresentaram imagem sugestiva de barreira mineralizada, mas apenas 1, a distal do 1º molar inferior direito, correspondia ao período de setenta dias e havia sido tratada com hidróxido de cálcio (Tabela 4, Figura 9). Interessante notar que todos os observadores foram concordes na identificação de imagem sugestiva de barreira em apenas 2 raízes, embora no período de sete dias, mas apenas três foram concordes na identificação da raiz distal do 1º molar inferior direito.
Resultados 44
Tabela 3. Indicação radiográfica sugestiva de barreira mineralizada (células em
destaque) no período de sete dias.
Observadores 1 2 3 4 Dentes Materiais D C D C D C D C 1º MID - mesial HC 1º MID - distal HC 1º MIE - mesial HC 1º MIE - distal HC 2º PMID MA 2º PMIE MA 3º PMID MA 3º PMIE MA CSD MA CSE HC 3º ISD MA 3º ISE MA D = Digital C = Convencional HC = Hidróxido de cálcio MA = Membrana absorvível
Resultados 45
Tabela 4. Indicação radiográfica sugestiva de barreira mineralizada (células em
destaque) no período setenta dias.
Observadores 1 2 3 4 Dentes Materiais D C D C D C D C 1º MID-mesial HC 1º MID-distal HC 1º MIE-mesial MA 1º MIE-distal MA 2º PMID MA 2º PMIE HC 3º PMID MA 3º PMIE MA CSD HC CSE MA 3º ISD MA 3º ISE MA D = Digital C = Convencional HC = Hidróxido de cálcio MA = Membrana absorvível
Resultados 46
A B C
I
II
Figura 6: Imagens radiográficas do 1o MID (hidróxido de cálcio - sete dias). I - Digital: A) Imagem padrão; B) Imagem negativa; C) Imagem 3D.
II - Convencional.
Resultados 47
A B C
I
II
Figura 7: Imagens radiográficas do 1o MIE (hidróxido de cálcio - sete dias). I
- Digital: A) Imagem padrão; B) Imagem negativa; C) Imagem 3D.
Resultados 48
A B C
I
II
Figura 8: Imagens radiográficas do CSE (hidróxido de cálcio - sete dias). I - Digital: A) Imagem padrão; B) Imagem negativa; C) Imagem 3D.
Resultados 49
A B C
I
II
Figura 9: Imagens radiográficas do 1o MID (hidróxido de cálcio - setenta dias). I - Digital: A) Imagem padrão; B) Imagem negativa; C) Imagem 3D.
Discussão 51
6. Discussão
O tratamento conservador por meio da pulpotomia visa manter a polpa radicular vital, saudável e completamente isolada da câmara pulpar por uma camada de dentina e odontoblastos. A formação de uma barreira mineralizada, após a realização da pulpotomia, isola o tecido pulpar remanescente dos efeitos tóxicos oriundos dos materiais restauradores ou mesmo de uma microinfiltração bacteriana50.
Para tanto, se faz necessária a utilização de materiais que promovam o reparo pulpar e estimulam a formação da barreira mineralizada, o que tem estimulado buscas incessantes por um material biológico ideal.
Até o momento, cães têm sido largamente utilizados como modelo experimental em pulpotomia, sendo também aceitos macacos e minipigs. Optou-se neste estudo pela utilização de cães uma vez que a maioria dos relatos na literatura os tem utilizado como modelo experimental, e pelo fato dos pesquisadores envolvidos terem conhecimentos dos procedimentos clínicos e cirúrgicos relacionados a este animal. Ainda, determinou-se a distribuição dos dentes e períodos experimentais, quantidade e distribuição dos animais, o material restaurador e a utilização do processo de perfusão para a fixação das peças, em estrita aplicação das normas da “International Organization for Standardization” (ISO) 7405:199727, com o intuito de permitir a reprodutibilidade do trabalho por
qualquer outro grupo de investigadores.
O hidróxido de cálcio foi usado como controle neste trabalho, apesar de não ser um material biológico56, devido ao sucesso clínico confirmado pela
Discussão 52
análise microscópica, como protetor do remanescente pulpar, demonstrado ao longo dos anos quando da sua utilização, e também, por ser preconizado pela norma nº 7405:199727 da ISO como controle em tratamentos conservadores do complexo dentina-polpa.
Na busca de agentes alternativos para a pulpotomia, visando manter a vitalidade e a função do complexo dentina-polpa e promover um processo de reparo mais natural e biológico, decidiu-se testar a membrana absorvível de cortical óssea bovina desmineralizada.
Os resultados microscópicos encontrados neste experimento demonstraram diferenças notáveis entre as respostas pulpares após o procedimento de pulpotomia e proteção dos remanescentes pulpares com membrana absorvível de cortical óssea bovina desmineralizada e hidróxido de cálcio.
Com a utilização do hidróxido de cálcio, os resultados observados tanto no período de sete como no de setenta dias, foram similares àqueles relatados por outros autores3,22,23,48,69,85. Inicialmente observou-se a zona de necrose formada
abaixo do material, e, no período mais longo, a formação de barreira de tecido mineralizado composta por dentina tubular na região próxima à polpa, apresentando continuidade com a dentina das paredes laterais do terço cervical, em todos os espécimes.
A biocompatibilidade da membrana de cortical óssea desmineralizada é claramente observada no período de sete dias, quando não se verifica necrose de coagulação, morte celular e presença de células do sistema
Discussão 53
imune. Em contra-partida, nas polpas protegidas com hidróxido de cálcio, a necrose por coagulação, após sete dias, é típica.
Os resultados obtidos após setenta dias, com a utilização da membrana absorvível, não foram satisfatórios, pois não houve formação de barreira de tecido mineralizado na embocadura de nenhum dos canais analisados. A formação de tecido mineralizado neoformado nas paredes dentinárias dos canais radiculares e a calcificação pulpar observada em apenas 2 raízes, parece estar relacionada com a presença de fragmentos de dentina, localizados no interior do tecido pulpar, sugerindo que eles tenham estimulado a formação de tecido duro, pois o tecido mineralizado encontrava-se em íntima relação com as partículas de dentina. Estes eventos foram relatados por HOLLAND et al. em 197821, quando utilizaram
fragmentos de dentina sobre o remanescente pulpar após pulpotomia em dentes de cães. Os fragmentos de dentina introduzidos para o interior da polpa durante o mecanismo de exposição, induzem formação de tecido mineralizado, assim como dentina desmineralizada implantada na polpa dentária, devido à capacidade da dentina induzir células mesenquimais indiferenciadas a se diferenciarem em odontoblastos42,75. Provavelmente, os fragmentos de dentina que penetraram no interior do tecido pulpar, foram provenientes da remoção da polpa coronária realizada com brocas21.
Nos demais espécimes do Grupo I, no período de setenta dias, houve formação de tecido conjuntivo fibroso aderido às paredes do canal, em toda sua extensão. Resultado semelhante foi relatado por NAKASHIMA em 199445, utilizando 0,66 µg de BMP-2 recombinante humana combinada com matriz de colágeno tipo I em polpas amputadas de cães, após setenta dias. Estes autores
Discussão 54
somente observaram a formação de tecido mineralizado utilizando 2 µg de BMP-2, sugerindo que os odontoblastos são estimulados de maneira dose dependente. O efeito dose dependente da BMP na indução de formação de dentina reparadora também foi observado quando se utilizou BMP bovina purificada associada ao colágeno insolúvel, sobre a polpa de macacos58.
Aparentemente, a quantidade de BMP presente na membrana absorvível de cortical óssea bovina desmineralizada, utilizada como material teste neste estudo, pode ter sido insuficiente para estimular a diferenciação de células mesenquimais indiferenciadas em odontoblastos. Por outro lado, a concentração de BMPs presente na matriz dentinária pode ser superior à encontrada na matriz óssea bovina, pois estudos demonstram indução de dentinogênse com a utilização de dentina alogênica desmineralizada42,75. Portanto, a hipótese de que a membrana absorvível pudesse induzir a formação de barreira de tecido mineralizado não foi confirmada.
É preciso considerar, ainda, a hipótese de que o processamento utilizado para a produção das membranas de osso cortical bovino desmineralizado tenha, de alguma forma, desnaturado os fatores de crescimento disponíveis na membrana. De acordo com dados fornecidos pelo fabricante, o processo de desmineralização do osso cortical bovino ocorre de maneira adequada e controlada, a baixa temperatura, dificultando a desnaturação protéica. Pesquisas serão necessários para estabelecer a concentração efetiva de fatores de crescimento, particularmente da BMP.
Um futuro promissor no tratamento de polpa vital parece ser evidente com o surgimento dos fatores de crescimento como indutores da formação
Discussão 55
dentinária. Contudo, novos estudos ainda serão necessários a fim de determinar a qualidade da proteção oferecida ao remanescente pulpar, visando a manutenção da sua vitalidade e integridade.
Foi também objetivo deste estudo analisar comparativamente a eficiência do método radiográfico digital em relação ao método convencional na indentificação da barreira mineralizada.
Por meio da análise microscópica sabe-se que não houve formação de barreira mineralizada em nenhuma raiz do período de sete dias. Setenta dias após a pulpotomia apenas nas raízes tratadas com hidróxido de cálcio (cinco) houve formação de barreira.
A análise radiográfica de 32 raízes indicou imagem sugestiva de barreira mineralizada em 4 raízes com a utilização do método digital (Digora), entretanto, todas estas referentes ao período de sete dias e tratadas com hidróxido de cálcio (Tabela 3) quando não houve formação de barreira, como confirmado pela análise microscópica.
Utilizando o método convencional, 5 raízes apresentaram imagem sugestiva de barreira mineralizada, sendo que todas essas raízes receberam o hidróxido de cálcio como material protetor e, apenas 1, era do período de setenta dias (Tabelas 3 e 4), quando efetivamente houve formação de barreira mineralizada confirmada pela microscopia.
Segundo SYRIOPOULOS et al. (2000)70, a habilidade do
avaliador é um fator importante na variabilidade do diagnóstico radiográfico, e não a modalidade da imagem. Quando as radiografias são tecnicamente bem feitas e o
Discussão 56
processamento digital ou químico é bem elaborado, a dificuldade encontrada para se comparar métodos diferentes de obtenção de uma imagem se remete ao observador, pois a interpretação da imagem sempre será subjetiva8.
Neste trabalho, apesar da análise radiográfica ter sido realizada por profissionais muito experientes e calibrados, apenas uma barreira mineralizada dentre as cinco induzidas pelo hidróxido de cálcio, no período de setenta dias, foi efetivamente identificada. Destaque-se, ainda, que um de quatro examinadores não identificou esta barreira (Tabela 4). Mais preocupantes foram os resultados falsos positivos observados em 4 raízes do período de sete dias, quando nenhuma barreira ainda havia sido formada (Tabela 3).
O número de imagens sugestivas de barreira mineralizada
obtidas por meio do método radiográfico digital foi inferior àquelas identificadas pelo método convencional e nenhuma delas foi coincidente com o resultado da análise microscópica. Estudos comparativos entre método radiográfico digital e convencional, demonstram que o digital pode ser menos sensível para visualizar determinadas imagens15,82, particularmente em função de suas dimensões e consistência,
sugerindo que o mesmo pode ter ocorrido em relação à presença da barreira mineralizada.
Tendo em vista os benefícios que a imagem digital pode trazer para acelerar os procedimentos, diminuindo a exposição do paciente e o impacto ambiental, o aprimoramento do sistema digital deve ser vigorosamente estimulado.
Entretanto, os resultados radiográficos encontrados neste trabalho não foram confirmados durante a análise microscópica. Da mesma forma, as barreiras mineralizadas encontradas microscopicamente, não foram observadas na
Discussão 57
análise radiográfica, não havendo, portanto, uma correspondência entre ambas1,47,48,68. Isto pode ter ocorrido devido a pouca mineralização da barreira ou
quando uma trabécula óssea é projetada estrategicamente sobre o local onde se espera que esteja a estrutura procurada. Assim, a presença ou ausência de áreas radiopacas próximas da área onde foi realizado o corte da polpa coronária, não é um indicativo de sucesso ou fracasso do tratamento conservador da polpa20.
Conclusões 59
7. Conclusões
Com base nos resultados obtidos neste experimento, pode-se concluir que:
• A membrana absorvível de cortical óssea bovina desmineralizada, apesar de biocompatível, não induziu formação de barreira de tecido mineralizado quando utilizada como protetor do remanescente pulpar após pulpotomia em dentes de cães;
• O método radiográfico convencional foi mais eficiente que o método digital (Digora) na identificação de barreira de tecido mineralizada, após pulpotomia em dentes de cães;
• Não houve correspondência entre os resultados microscópicos e radiográficos encontrados após a realização da pulpotomia em dentes de cães, nos períodos experimentais de sete e setenta dias.
Referências Bibliográficas 61
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periápice através da imagem digital indireta utilizando o programa Adobe Photoshop 5.0. Bauru, 2002. 127p. Dissertação (Livre-Docência) -
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