10.1 Gel de Poliacrilamida – Eletroforese vertical 10.1.1 Soluções
9 Tampão TBE 10X pH 8,0 (Tris/HCl 0,89 M, EDTA 0,08 M, Ácido Bórico 0,89 M);
9 Solução de acrilamida a 29% + bis-acrilamida a 1%; 9 Glicerol;
9 TEMED (N,N,N’,N’, tetrametiletilenodiamina); 9 Persulfato de potássio ou amônia a 0,1%.
10.1.2 Preparo das amostras para aplicação no sistema de eletroforese
As amostras foram preparadas para eletroforese adicionando-se tampão de corrida, acrescido do corante bromofenol. A seguir será demonstrada a especificidade do preparo para cada marcador analisado.
Para os marcadores microssatélites, adicionou-se formamida (900 µl de formamida para 300 µl de corante) ao tampão de corrida. As amostras foram submetidas a um aquecimento físico a 95ºC por 10 (dez) minutos antes da aplicação no gel, favorecendo a desnaturação com o intuito de abrir a dupla fita de DNA. Imediatamente após a desnaturação, as amostras foram submetidas a um choque térmico (imersão em gelo) e posteriormente aplicadas nos poços do gel de poliacrilamida desnaturante.
10.1.3 Procedimento
a) Após a assepsia das placas de vidro, montar as placas com espaçadores prendendo com grampos de aço;
b) Preparar uma solução de poliacrilamida nas concentrações de 6% (gel 6%) ou 10% (gel 10%) na proporção conforme Tabela 3;
c) Adicionar a esta solução, se necessário, 35% de glicerol;
d) Adicionar os catalisadores TEMED e Persulfato de Amônia na proporção conforme consta na Tabela 3;
e) Inserir rapidamente o gel não polimerizado pela borda superior e colocar o pente;
f) Tempo médio de polimerização: 30 minutos.
10.1.4 Condições de pré-corrida do gel de poliacrilamida
Nos sistemas em que a análise foi realizada em gel de poliacrilamida, realizou-se uma pré-corrida, onde somente o gel era submetido em voltagem fixa de duzentos Volts por um tempo de vinte minutos. Em todos os procedimentos de eletroforese, iniciou-se a corrida com uma voltagem mais baixa, em torno de 80 Volts, para que as amostras iniciassem a saída do poço uniformemente. Após 20 minutos a voltagem ideal foi ajustada a cada sistema.
Após a pré-corrida e verificação das condições ótimas de corrida, os poços foram novamente limpos com tampão TBE 1X. Posteriormente foram aplicadas todas as amostras no gel juntamente com os padrões dos alelos dos respectivos marcadores intercalando a cada três ou quatro amostras. Para os sistemas de STRs e o M3, os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese com voltagem constante de 200V e amperagem variável. O tempo de corrida era específico para cada sistema variando de acordo com o tamanho dos fragmentos amplificados: 3h50’ para o DYS19, DYS390 e DYS391; 2h30’ para o DYS393, e para o M3 o tempo de corrida era em torno de 1h30’. Em relação aos produtos do sistema AluYAP, estes foram submetidos a uma voltagem de 150 Volts por um período 1h50’. Logo após a eletroforese, os géis seguiam para o procedimento final de coloração, utilizando nitrato de prata (Sanguinetti et al., 1994).
10.1.5 Leitura dos géis
As determinações dos perfis alélicos e genotípicos foram realizadas por comparações visuais entre os alelos padrões e o alelo presente em cada amostra. As leituras dos géis foram realizadas com auxílio de um transiluminador – Macro VUE UVIS-20 - com luz branca (visível). Uma segunda leitura dos resultados foi confirmada posteriormente utilizando-se a escolha de amostras ao acaso.
Tabela 3: Componentes e quantidades do preparo do gel de poliacrilamida Gel não desnaturante Gel desnaturante
Componentes do gel 6% 10% 10% H20 mili-Q (ml) 15,75 9,6 9,6 Uréia* (g) - - 9,6 Acrilamida + bisacrilamida (ml) 5,0 6,6 6,6 Glicerol (ml) 1,75 1,4 - Tampão TBE 10X pH 8,0 (ml) 2,5 2,0 2,0 TEMED (μl) 18 15 15 Persulfato de Amônia 0,1% (μl) 350 300 300 * No preparo do gel desnaturante, primeiro adiciona-se uréia à água. Aquecer por 1 minuto no forno de microondas para melhor dissolução do soluto. Após essa etapa inicial, o preparo segue as mesmas etapas do gel não desnaturante.
10.1.6 Eletroforese: montagem e condições a) Diluir o tampão TBE 10X na proporção 1:10;
b) Colocar o tampão diluído na parte inferior da cuba; c) Retirar os grampos e os pentes da placa;
d) Lavar as bordas superiores e inferiores do gel com água deionizada; e) Montar o gel na cuba de eletroforese;
f) Preencher a parte superior da cuba com tampão TBE diluído;
g) Lavar os poços dos géis com auxílio de pipetador ou seringa Hamilton; h) Aplicar as amostras (7,0 μl de produto de PCR e 3,0 μl de tampão de
corrida);
i) Conectar a cuba com a fonte;
j) Estabelecer a voltagem máxima pretendida (de acordo com o sistema analisado) e liberar a amperagem.
10.1.7 Coloração do gel de poliacrilamida com Nitrato de Prata 10.1.7.1 Soluções
9 Solução fixadora: Etanol (144,0 ml), Ácido acético (6,0 ml) e Água deionizada (750,0 ml)
9 Solução de Prata: Nitrato de prata (0,2%g + 10,0 ml de água deionizada) 9 Solução Reveladora: Hidróxido de sódio (22,5g) e água deionizada (q.s.p.
10.1.7.2 Procedimento
a) Após desligar a fonte, desfazer a moldura do gel e transferi-lo para um recipiente contendo 200 ml de solução fixadora (ácido acético a 10%); b) Deixar permanecer nessa solução por aproximadamente 20 minutos; c) Descartar a solução fixadora e lavar o gel em água deionizada três vezes
por aproximadamente 3 minutos cada;
d) Descartar a água e colocar a solução de nitrato de prata por 30 minutos; e) Descartar a solução de nitrato de prata e lavar imediatamente o gel em
água deionizada por 20 segundos;
f) Adicionar a solução reveladora, agitar levemente até que a revelação esteja completa;
g) Descartar o revelador e bloquear a reação com solução fixadora; h) Proceder à leitura.
10.1.7.3 Secagem do gel a) Solução
9 Solução de secagem: glicerol 40% em ácido acético 10%.
b) Procedimento
a) Hidratar duas folhas de papel celofane transparente; b) Esticar uma das folhas em uma placa de vidro;
c) Colocar igual quantidade de solução de secagem suficiente para encobrir a extensão do papel celofane a ser utilizado;
d) Colocar sobre o conjunto o gel a ser seco, devidamente etiquetado;
e) Colocar uma quantidade de solução de secagem suficiente para encobrir o gel;
f) Estender a segunda folha de papel celofane hidratado sobre o gel; g) Deixar secar a temperatura ambiente.
** Observação:
Metodologia de secagem alternativa do gel: colocar o gel por 2 horas em água destilada e proceder à secagem sem o uso de solução de ácido acético com glicerol.
10.2 Gel de agarose – Eletroforese horizontal 10.2.1 Soluções
9 Agarose a 1% e 2,5% 9 TBE 1X
10.2.2 Procedimento
a) Após a assepsia da placa, montar o conjunto da mesma;
b) Preparar uma solução de agarose nas concentrações de 1% ou 2,5%. Adicionar 2,0 μl do Brometo de Etídeo na solução de agarose. Usa-se o gel a 1% para verificar os produtos de amplificação e o gel a 2,5% para verificação dos produtos de digestão;
c) Inserir rapidamente o gel não polimerizado na placa e colocar o pente; d) Tampar com papel alumínio e aguardar a polimerização;
e) Tempo médio de polimerização: 20 minutos.
10.2.3 Eletroforese: montagem e condições a) Diluir o tampão TBE na proporção 1:10; b) Colocar o tampão diluído na cuba; c) Retirar o pente do gel;
d) Colocar o gel na cuba de eletroforese horizontal;
e) Aplicar as amostras (5,0 μl de produto de PCR e 5,0 μl de tampão de corrida);
f) Conectar a cuba com a fonte;
g) Estabelecer a voltagem máxima pretendida (de acordo com o sistema analisado) e liberar a amperagem.