PROCEDIMENTO PARA O PREPARO DE MEIOS DE CULTURA LÍQUIDOS (CALDOS):

10. Pesar a quantidade do meio de cultura desidratado indicado no rótulo do frasco; 11. Medir a quantidade de água destilada indicada no rótulo, em uma proveta; 12. Em um balão volumétrico, dissolver o pó nos 100 ml de água destilada; 13. Agitar para dissolução do pó;

14. Pipetar quantidade necessária em tubos de ensaios, enlenmeyers ou balões; 15. Esterilizar em autoclaves.

16. Efetuar o controle de qualidade dos meios de cultura colocando-os em uma estufa à 37 °C. Após 24hs observar se houve o crescimento de colônias ou turvação do meio. Se houve é porque ocorreu

contaminação desse meio e o mesmo não está esterilizado não podendo ser utilizado – deve-se descartá- lo. Se não houve, é porque o meio está realmente esterilizado, podendo ser utilizado.

17. Os meios que passaram no teste de esterilização deve ser armazenados na geladeira para posterior uso.

Exercícios de fixação:

1. Porque os microrganismos utilizam meios quimicamente definidos? 2. Porque o Agar é o agente solidificante ideal para uso em microbiologia?

3. Qual é a constituição do Agar? Qual é a finalidade de sua incorporação no meio de cultura? 4. Quando um microbiologista utiliza um meio de enriquecimento para o cultivo de microrganismos? 5. Como são preparados os meios de cultura? Descreva o procedimento.

ANOTAÇÕES:

MATERIAIS:

AULA PRÁTICA

ASSUNTO: Técnicas de Semeadura:

Placas de Petri (Contagem e Isolamento)

TEORIA:

• Em laboratório os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura.

• Alguns laboratórios preparam seus próprios meios a partir de pós desidratados, enquanto outros compram meios preparados (“prontos para uso”) em placas de Petri ou tubos de ensaio. • Existe à disposição uma extensa lista de meios comerciais, e o tipo utilizado depende de muitos

fatores.

• Esses fatores incluem considerações sobre a origem do material a ser analisado, a espécie que se imagina estar presente nesta amostra e as necessidades nutricionais dos microrganismos.

• Numa análise microbiológica, a amostra de alimento deve ser preparada e depois inoculada ao meio de cultura;

• O material colocado no meio de cultura é chamado de inóculo.

• Esta inoculação pode ser por diferentes técnicas de acordo com o que se pretende (contagem de colônias ou isolamento de um microrganismo)

• Após a inoculação, o meio é incubado, para que ocorra o desenvolvimento dos microrganismos. • Durante a incubação do meio inoculado, as células individuais de cada microrganismo inoculado,

multiplicam-se e produzem um grande número de células, que juntas formam uma colônia • Visível a olho nu, cada colônia é uma cultura pura com um ancestral único.

• Morfologicamente, as colônias não são iguais para todos as espécies.

• P. ex. algumas espécies de microrganismos podem formar uma colônia aderente (pegajosa), elevada, enquanto outras formam colônias lisas e secas.

Semeaduras:

• Os microrganismos necessitam de um meio de cultura adequado para o seu crescimento in vitro. Mas, além dos componentes presentes no meio, outros fatores interferem no seu desenvolvimento: são fatres ambientais como temperatura (psicrófilos, mesófilos, termófilos) e tensão de oxigênio (aeróbias, anaeróbias facultativas, microaerófilas).

• Inoculando um microrganismo em um meio de cultura que possua todos esses requisitos nutritivos e fatores ambientais favorecidos, o microrganismo inicia o seu desenvolvimento neste meio, passando pelas fases da curva de crescimento, desde a fase de latência, logaritmica, estacionária até a fase de morte.

• A fase logaritmica (exponencial) é caracterizada por divisões sucessivas (cissiparidade, originando a formação de um grupamento de bactériasda mesma espécie, que é denominado de colônia (massa de célula). Essa évisualizada sem o auxílio do microscópio, sendo então considerada como característica macroscópica das bactérias.

• Como cada espécie possui um tipo morfológico colonial diferente, estas devem ser analizadas, quanto à elevação, forma, tamanho, bordas e pigmentação. Em um meio de cultura, um único tipo de colônia observado é denominado cultura pura; vários tipos de colônia, cultura mista. Em microbiologia, há várias técnicas de inoculação de microrganismos; algumas são utilizadas para exames qualitativos e outras para estudos quantitativos (contagem de bactérias).

• Dentre as técnicas empregadas, encontramos: o _{Estrias em superfície (esgotamento):}

 Estrias contínuas: em tubos e placas  Estrias descontínuas: em placas

o Diluição:

 Pour plate: com ágar liquefeito (placas)  Superfície (placas)

 Em meio líquido: profundidade (tubos) Normas Utilizadas:

a) O fio da alça de platina devem sempre ser flambados antes e depois de qualquer inoculação, ou seja, devem ser aquecidos ao rubro no cone interno da chama do bico de Bunsen. Para a coleta de material, devem ser esfriados na parte interna do recipiente com o enio de cultura.

b) Os recipientes (tubos de ensaio, placas de Petri, etc) com meio de cultura, devem sempre ser abertos próxmo à chama do bico de Bunsen.

c) A boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida após a retirada da tampa e antes da colocação da tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão direita durante a ioculação.

Método:

1) Estrias Cotínuas:

a) Tubos: Podemos usar meios sólidos com bisel curto ou longo e sem bisel. O bisel curto é semeado com agulha de níquel cromo, inserindo-a no meio até quase o fundo do mesmo e em seguida, estriando-se a superfície do bisel. Esta forma é utilizada em meios de identificação de bactérias. O bisel longo é utilizado principalmente para a conservação de cepasde bactérias e fungos, onde semeia-se com a alça ou agulha, estriando a superfície do bisel. No sem bisel a inoculação deverá ter a profundidade de 2/3 do meio e nãodeverá ter mais do que uma única picada. Semeia-se com agulha; é mais utilizado para se verificar a motilidade das bactérias.

Interpretação dos Resultados: Para avaliar a leitura dos resultados desta técnica deve-se observar os seguintes ítens:

- Quantidade: pode ser escassa, moderada ou abumdadnte.

- Margens ou bordos do crescimento: pode ser descrita como uniforme ou nítida, ou mostrando várias irregularidades.

- Consistência da massa de crescimento: pode ser butírica ou de consistência semelhante à de manteiga, facilmente removivel com a alça de platina, viscosa ou mucóide, seca ou quebradiça.

- Cromogênese ou pigmentação: pode ser opaca,translúcida ou com pigmentos. Em tubos sem bisel a interpretação dos resultados se baseia em:

- Resultado positivo: crescimento por todo o meio, semelhante a um pinheiro invertido (microrganismo com motilidade).

- resultado negativo: o crescimento ocorre somenteno local da inoculação.

b) Placas: O estriamento contínuo é feito com alça de níquel cromo, semeando em zigue-zague sobre toda a superfície da placa.

Interpretação dos resultados: - Tamanho das colônias;

- Bordos: a perfiferia das colônias bacterianas formam muitos desenhos diferentes dependendo das espécies. Podem ser inteiros, lobulados, ondulados, denticulados ou franjados.

- Elevação: Achatadas, espraiadas, convexas, umbilicadas, centro saliente. Cromogênese ou pigmentação: pode ser poca, translúcida ou com pigmentos. Forma: ascolônias podem ser circulares, irregulares ou rizóides.

- Consistência da massa de crescimento: butírica (como manteiga), facilmente removível com a alça de platina, viscosa ou mucóide, seca ou quebradiça.

2) Estrias Descontínuas:

a) Placas: A semeadura por esgotamento descontínuo é mais apropriada para o isolamento de colônias de bactérias. Esta semeadura deve ser feita espalhando-se a amostra com uma alça de platina em um terço da placa, logo em seguida flabar a alça e a partir desse inóculo fazer o espalhamento. Deve-se

passar a alça sobre o inóculo e a semeadura em forma de zigue-zague não tocando mais o inóculo inicial.

Obs. O sucesso da semeadura está em : - Grande número de estrias

- Não perfurar o meio

- Não voltar a lça sobre a estria

- Pegar pequena quantiade do material para estriar. 3) Diluição:

a) Pour Plate: liquefazer o meio de cultura. Colocar em uma placa de Petri, com uma pipeta previamente esterilizada, 1 ml do inóculo e verter 15 – 20 ml do meio de cultura liquefeito (e resfriado à 45 – 42 oC). Homogeneizar com movimentos circulares em 8 (10 x) e esperar solidificar. A te´cnica pour plate pode ser realizada com o onjetivo de se obter colônias isoladas (estudo qualitativo) ou para realizar a contagem de colônias em placas (estudo quantitativo).

Interpretação dos resultados: Para o resultado quantitativo realizar a contagem das colônias escolhendo a placa que contenha de 25 – 250 colônias. Em seguida realizar o cálculo.

b) Superfície (Spread Plate): Nesta técnica o meio já deve estar solidificado na placa. Com um pipeta previamente esterilizada, colocar sobre o meio 0,1 ml do inóculo e espalhar com alça de Drigalski. c) Meios líquidos: A introdução do inóculo e meio líquido pode ser feita com uma alça de níquel

cromo ou com uma pipeta. Com a alça, introduzi-la no meio e agitá-la levemente. Com a pipeta, depositar o inóculo no fundo do tubo e aspirar algumas vezes com a pipeta para homogeneizar. Interpretação dos resultados: O resultado de crescimento no meio líquido é observado por:

- Quantidade de crescimento, que pode ser escassa, moderada ou abundante;

- Distribuição de crescimento: pode ser crescimento uniformemente distribuído (nitidamente turvo),

crescimento confinado à superfície do meio como uma espuma ou filme (película); ou crescimento acumulado como sedimento que pode ser granuloso ou viscoso; e ainda verificar o odor, que pode ser pútirdo, aromático ou desprezível.