R1. Tubos de Anticorpos anti-VSR
R2. Anticorpos monoclonais anti-VSR conjugados com HRP R3. Solvente da amostra
R4. Controlo positivo R5. Tampão do substrato R6. Cromogénio
R7. Tampão de Tratamento do Ensaio
B) MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. Água desionizada ou água destilada para a diluição do ácido sulfúrico e lavagem dos tubos. 2. Ácido sulfúrico H2SO41N para fazer parar a reacção antes da análise espectrofotométrica. Use
um reagente de qualidade analítica de H2SO4concentrado para preparar a solução 1N. Para preparar 500 ml de H2SO41N, junte 14 ml de H2SO4concentrado a 486 ml de água destilada ou desionizada. Guarde em recipiente de vidro bem tapado à temperatura ambiente (23 °C ± 3 °C).
3. Suportes de tubos de teste com capacidade para tubos de 12 x 75 mm.
4. Pipetas com pontas descartáveis para as capacidades de 100 µl, 300 µl e 500 µl. 5. Pipetas serológicas descartáveis de 10 ml.
6. Tubos de teste de vidro descartáveis de 12 x 75 mm.
7. Limpe o tubo de vidro para a preparação do solução de desenvolvimento de substrato (ver o procedimento - passo 9).
8. Película de plástico.
9. Sistema para a lavagem dos tubos que inclui os mecanismos de enxaguamento e de aspiração, frascos apropriados e tubagens para a recolha do líquido residual (ver o diagrama 1). a)Aparelho de lavagem: garrafa de lavagem de plástico, b) Aparelho de aspiração: extremidade de aspiração e bomba de vácuo.
10. Agitador de vórtex.
11. Espectrofotómetro com comprimentos de onda variáveis dentro da gama do visível e uma gama de linearidade de 0 a 2,0 unidades de absorvância para ler a absorvância a 450 nm. 12. Hipoclorito de sódio (lixívia) para a descontaminação.
13. Temporizador para marcar intervalos de tempo de 15 e 60 minutos.
DIAGRAMA 1
Equipamento de Aspiração
Comentários ao procedimento
1. Coloque os reagentes e as amostras à temperatura ambiente (23 °C ± 3°C) antes da utilização.
2. A incubação a outras temperaturas ou intervalos de tempo que não os especificados pode levar a resultados erróneos.
3. Ao adicionar os reagentes, evite esperas ou interrupções. Não deixe que os tubos sequem (ao ar) se o ensaio já tiver sido iniciado.
4. CUIDADO: Não pipetar com a boca.
5. Pipete sempre com a ponta da pipeta encostada ao fundo do tubo. Não despeje os reagentes ao longo da parede do tubo. Não toque com a ponta da pipeta na solução de reacção. 6. Mude as pontas da pipeta entre amostras.
7. A vidraria reutilizável deve ser lavada e abundantemente enxaguada para arrastar detergentes. Use água desionizada ou destilada.
8. Todos os reagentes foram optimizados para a detecção do VSR. A diluição ou adulteração destes reagentes pode resultar em perda de sensibilidade.
C) PROCEDIMENTO
Efectue uma boa homogeneização de todos os reagentes antes de os utilizar.
1. Identifique com uma etiqueta um Tubo de Anticorpo para o controlo negativo e outro para o controlo positivo. Identifique um tubo de anticorpo para cada amostra de cada doente. NOTA : Um controlo positivo e um controlo negativo (solvente da amostra) devem fazer parte de cada ensaio.
76 Pipeta de aspiração Recipiente de segurança Bomba de vácuo
2. Junte 1 gota do Tampão de Tratamento do Ensaio a cada tubo. 3. Junte 100 µl de Anticorpo Monoclonal Conjugado com HRP a cada tubo.
4. Junte 300 µl de Solvente da Amostra ao tubo do controlo negativo; junte 300 µl de Controlo Positivo ao tubo do controlo positivo.
5. Adicione a amostra de cada doente ao tubo com a etiqueta apropriada seguindo as instruções seguintes:
Se a amostra é recebida no meio de transporte sem soro, centrifugue intensamente a amostra e adicione 300 ul no tubo apropriado. Se a amostra não se apresenta num meio de transporte, dilua com um volume igual do Diluente de Amostra PATHFINDERTM. Adicione 300 ul da amostra diluida ao tubo apropriado.
Uma maior diluição da amostra para além do recomendado pode resultar em perda de sensibilidade.
6. Agite os tubos suavemente e coloque-os em incubação à temperatura ambiente (23 °C ± 3 °C) durante 60 minutos ± 10 minutos.
7. Aspire cuidadosamente as amostras dos tubos.
8. Lave cada tubo 6 vezes com 2 ml a 4 ml de água desionizada ou destilada, em cada lavagem. Remova o excesso de humidade dos tubos após a lavagem final, invertendo-os e secando a borda com uma toalha de papel ou através de aspiração dos tubos. Uma lavagem inadequada ou uma lavagem com água impura podem originar resultados erróneos.
9. Prepare o reagente de desenvolvimento de cor.
CUIDADO: Não permita o contacto entre o Cromogénio ou o reagente de desenvolvimento da cor e qualquer metal ou agente oxidante.
A) Quantidade necessária de Tampão de Substrato = 0,5 ml de Tampão por tubo de ensaio. Quantidade necessária de Cromogénio = 1 gota de Cromogénio por ml de Tampão de Substrato.
Exemplo: Para 6 tubos de ensaio,
• A quantidade necessária de Tampão de Substrato = 3,0 ml ; • A quantidade necessária de Cromogénio = 3 gotas.
Junte a quantidade necessária de Tampão de Substrato e Cromogénio a um tubo limpo de vidro ou de plástico.
B) Tape o tubo com película de plástico e faça a homogeneização do conteúdo invertendo o tubo várias vezes. Use a solução do substrato dentro de 30 minutos. Minimize a exposição à luz. A geração espontânea de uma cor azul pode ser indicativa de contaminação de reagente. O reagente de desenvolvimento de cor deve manter-se incolor antes da utilização.
10. Junte 0,5 ml do reagente de desenvolvimento de cor a cada tubo. Agite os tubos suavemente e coloque-os em incubação (23 ± 3°C) durante 15 minutos, minimizando a exposição a luz forte. Não deixe que a reacção de formação de cor exceda 15 minutos.
11. Faça a leitura dos tubos visualmente ou por espectrofotometria para determinar os resultados do teste.
Determinação visual
Não pare a reacção através da adição de ácido.
No fim do período de incubação, o tubo do controlo negativo deve estar incolor. O controlo positivo deve apresentar a coloração azul escura. As amostras com coloração azul são positivas para o antigénio do VSR. As amostras sem coloração azul são negativas para o antigénio do VSR.
Nota: Os resultados visuais de amostras fracamente positivas devem ser processados e lidos pelo método seguinte de Determinação Espectrofotométrica.
Determinação Espectrofotométrica
A) Junte 1 ml de H2SO4 1N a cada tubo pela mesma ordem e aproximadamente no mesmo intervalo de tempo em que é adicionado o reagente de desenvolvimento de cor a cada tubo. Agite os tubos no agitador de vórtex. Retire as bolhas de ar antes de ler a absorvância. Após a adição de ácido a cada tubo, o material da reacção final é muito estável durante cerca de 8 horas, se for protegido da luz.
B) Use água desionizada ou água destilada como branco do espectrofotómetro, a 450 nm. C) Leia a absorvância a 450 nm do controlo negativo (solvente da amostra), controlo positivo e
tubos de amostra. Para fazer a distinção entre amostras positivas e negativas, calcule o valor do Ponto-de-corte e a Zona Cinzenta, tal como está descrito na secção de “Resultados”.
Um valor superior ou igual a 0,06 unidades de absorvância para o controlo negativo (solvente da amostra) indica uma possível contaminação de reagente ou uma lavagem inadequada.
8- CONTROLO DE QUALIDADE
Um controlo positivo e negativo devem fazer parte de cada ensaio.
Controlo Negativo (Solvente da Amostra)
Visual : O Controlo Negativo deve ser incolor.
Espectrofotometria : O valor da absorvância deve ser inferior a 0,06 unidades.
Controlo Positivo
Visual : O Controlo Positivo deve apresentar a coloração azul escura. Espectrofotometria : O valor da absorvância deve ser superior a 0,6 unidades. Se os controlos não reagirem da maneira esperada, os resultados não são válidos.
9- DETALHES DA CALIBRAGEM
Apenas Método Espectrofotométrico1. Calcule o valor do Ponto-de-corte através da adição do factor 0,075 ao valor da unidade de absorvância do controlo negativo (solvente da amostra).
Exemplo: Valor do controlo negativo 0,017 + 0,075 Valor do Ponto-de-corte = 0,092
2. Calcule a Zona Cinzenta. A Zona Cinzenta é igual a ± 10 % do valor do Ponto-de-corte (ou 0,90 a 1,10 vezes o valor do Ponto-de-corte).
Exemplo: Valor do Ponto-de-corte = 0,092 Zona Cinzenta = 0,083 a 0,101
Valor do Ponto-de-corte x (0,90) = (0,092) x (0,90) = 0,083 Valor do Ponto-de-corte x (1,10) = (0,092) x (1,10) = 0,101
10- RESULTADOS
a) VisualAs amostras com coloração azul são positivas para o antigénio do VSR. As amostras sem coloração azul são negativas para o antigénio do VSR. O controlo negativo deve ser incolor. O controlo positivo deve apresentar a coloração azul escura.
b) Espectrofotometria
As amostras com valores de absorvância inferiores ou iguais ao valor mínimo do Ponto-de-corte da Zona Cinzenta são negativas para o antigénio do VSR.
Uma amostra com um valor de absorvância dentro da Zona Cinzenta é questionável. O laboratório deve repetir o teste. Se o resultado repetido, usando quer a mesma amostra quer uma nova amostra, apresentar um valor de absorvância dentro da Zona Cinzenta, os resultados devem ser reportados como não determinantes.
As amostras com valores de absorvância superiores ou iguais ao valor máximo do Ponto-de-corte da Zona Cinzenta são positivas para o antigénio do VSR.
As amostras fortemente positivas podem dar origem à formação de precipitados negros no tubo.
11- LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
1. A infecção por outros patogenes respiratórios pode estar presente simultaneamente com a infecção por VSR, portanto, podem ser indicados testes adicionais em paralelo com o teste PATHFINDERTMRSV. Consulte a secção «Características Específicas de Desempenho» para os estudos de reactividade cruzada bacteriana e viral.
2. Um resultado de teste negativo não significa que está excluída a possibilidade de infecção por VSR. Pequenas quantidades de vírus, a obtenção tardia da amostra na infecção ou técnicas inadequadas ou impróprias de amostragem podem originar um resultado falsamente negativo. 3. Este teste permite detectar formas não viáveis do VSR (cultura negativa).
4. Os resultados deste teste devem ser interpretados conjuntamente com a informação disponível da avaliação clínica do doente e de outros procedimentos de diagnóstico.
5. Os resultados deste teste são qualitativos e devem ser considerados quer positivos quer negativos para o VSR.
12- VALORES EXPECTÁVEIS
Os valores expectáveis podem variar em função da população de doentes estudada, localização geográfica e altura do ano. A infecção pelo vírus sincicial respiratório pode ocorrer em todos os grupos etários. A doença é mais comum em crianças pequenas de 6 meses a 6 anos de idade, com um pico aos 2 meses (1). O diagnóstico clínico mais comum nestas crianças inclui a bronquite, bronquiolite e pneumonia. A infecção pelo VSR é comum em adultos, mas tende a ser menos grave do que em crianças. Os sintomas podem incluir a rinorreia, faringite, tosse, dor de cabeça, fatiga e febre (4). Os doentes idosos com infecção por VSR podem contrair broncopneumonia, que pode ser grave ou fatal (17).