Procedimento In Vitro – Citotoxicidade

O procedimento in vitro de citotoxidade foi feito seguindo duas metologias em Laboratórios diferentes como descritos a seguir.

Os ensaios de citotoxicidade das NPM’s de Fe3O4, CoFe2O4 dos híbridos Fe3O4@SiO2 e CoFe2O4@SiO2 e da hidroxiapatita (HAp) sintetizada no LaBSmaC, foram realizados no Laboratório Biosintesis P&D do Brasil LTDA em São Paulo – SP de acordo com a parceria estabelecida com a Empresa JHS Laboratório Químico LTDA (JHS Biomateriais).

Para a realização do ensaio, pesou-se aproximadamente 800 mg do controle negativo e do controle positivo. As amostras dos materiais de referência foram utilizados para preparar dois extratos na concentração de 200 mg/mL, em que, os mesmos foram preparados de acordo com o POP_TEC_002 – Preparação dos Extratos.

A aplicação e preparação das substâncias em teste, ocorreu pesando-se 1,86 g dos pós, em dois tubos de 15 mL, onde as amostras em teste foram utilizadas para preparar dois extratos na concentração de 200 mg/mL, também de acordo com o POP_TEC_002 – Preparação dos Extratos.

Para a condução dos testes de citotoxicidade utilizam-se células de ovário de hamster chinês da linhagem CHO-K1 (ATCC CCL-61), as quais foram mantidas em cultura conforme o procedimento POP_TEC_003 – Manutenção da Cultura Celular, até serem utilizadas no teste.

Buscou-se avaliar a viabilidade do uso das NPM’s dos híbridos Fe3O4@SiO2, CoFe2O4@SiO2 e da hidroxiapatita (HAp) sintetizada no LaBSmaC. Este método representa uma simulação in vitro da filtração e difusão dos materiais no disco. Foi utilizada uma câmara pulpar laboratorial, “In

Vitro Pulp Device” (IVPD), fazendo o cultivo de células odontoblastóides

MDPC-23.

Para quantificar o material e/ou seus componentes que se difundem através do disco, foram utilizados radioisótopos para marcar o material experimental e medir a concentração do material difundido por calorimetria, espectrofotometria ou cromatografia (Costa e Souza, 2005).

células que permanecem viáveis, após a exposição da população celular a diversas concentrações do extrato da substância teste. Para calcular essa porcentagem utiliza-se um corante vital e um agente acoplador de elétrons que ao ser incorporado pela célula produz um composto de coloração específica que pode ser detectado por um espectrofotômetro. A intensidade da cor resultante da incorporação celular é diretamente proporcional ao número de células viáveis em cultura. Uma amostra é considera citotóxica se a viabilidade celular (V.C.) resultante da exposição das células ao extrato de maior concentração for menor do que 70% (V.C. < 70%).

O teste de citotoxicidade das NPM’s dos híbridos Fe3O4@SiO2 e CoFe2O4@SiO2 e da hidroxiapatita (HAp) sintetizada no LaBSmaC será conduzido de acordo com as normas ISO 10993-5 (Biological Evaluation of

Medical Devices – part 5 - Tests for in vitro cytotoxicity) e ISO 10993-12 –

(Biological Evaluation of Medical Devices – part 12: Sample preparation and

reference materials), em que para a condução desse teste utilizou-se células de

ovário de hamster chinês da linhagem CHO-K1 (ATCC CCL-61). Os materiais de referência utilizados foram o PEAD (controle negativo – não citotóxico) e o látex (controle positivo – citotóxico).

De acordo com as normas ISO 10993-5 (Biological Evaluation of Medical

Devices – part 5 - Tests for in vitro cytotoxicity) e ISO 10993-12 – (Biological Evaluation of Medical Devices – part 12: Sample preparation and reference materials), a citotoxicidade de uma amostra é determinada pela porcentagem de

células que permanecem viáveis, após a exposição da população celular a diversas concentrações do extrato da substância teste. Para calcular essa porcentagem utiliza-se um corante vital e um agente acoplador de elétrons que ao ser incorporado pela célula produz um composto de coloração específica que pode ser detectado por um espectrofotômetro. A intensidade da cor resultante da incorporação celular é diretamente proporcional ao número de células viáveis em cultura. Uma amostra é considera citotóxica se a viabilidade celular (V.C.) resultante da exposição das células ao extrato de maior concentração for menor do que 70% (V.C. < 70%).

O ensaio de citotoxicidade dos compósitos híbridos por sua vez, foi realizado no Laboratório de Imunologia Celular & Bioquímica de fungos e

protozoários (LICBfp) da Universidade Federal de São Paulo no Campus de Diadema.

A linhagem celular utilizada para os ensaios de citotoxidade foram as células de ovário de hamster chinês (CHO-K1), provenientes da American Type

Culture Collection (ATCC®_{,CCL-61™). O cultivo celular foi realizado em meio}

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco®_{), suplementado com 10%} (v/v) de Soro Fetal Bovino (Vitrocell®_{), 2 g/L de bicarbonato de sódio (Synth}®_), 1% (v/v) da solução de antibióticos contendo 10.000 UI/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina) (Vitrocell®_).

A incubação celular ocorreu a 37 ºC em atmosfera úmida e 5% de CO2 e o meio foi substituído a cada 2 dias até as células atingirem 80% de confluência no frasco de cultura celular (75 cm2 _{e 150 cm}2_{, Nest}® _{e TPP}®_). Quando atingiram 80 % de confluência, foram descoladas das garrafas por ação da tripsina (Solução tripsina 0,05% e EDTA 0,02% em tampão fosfato pH 7,2), repicadas e plaqueadas em placas de 96 poços (P96w), com 20000 células por poço.

Foram pesadas 0,1 g de amostra (100 mg) e diluidas em 1 mL de PVA 20% acrescidas de 9 mL de meio RPMI10% sendo esta considerada a maior concentração. A seguir foram realizadas 7 diluições 1:2. Cada amostra foi agitada utilizando-se vortex antes da diluição.

Como controles foram preparados diluições seriadas do solvente utilizando (PVA à 20%) em oito concentrações diluídas da mesma forma.

As placas com as amostras foram incubadas por 24h a 37o _{C e 5% de} CO2. As amostras foram retiradas e as células viáveis foram avaliadas com o corante Neutral Red 50 μg/mL (Sigma) por 3 horas. Os poços foram lavados com 100 μL de solução salina. Uma solução DESORB foi preparada com ácido acético 1%, água purificada 49% e etanol 50%.

Os ensaios foram realizados de acordo com o Guidance document on

using cytotoxicity tests to estimate starting doses for acute oral systemic toxicity tests (OECD 129, 2010) em condições assépticas de acordo com as

recomendações do OECD Principles on Good Laboratory Practice (OECD, 1998). O esquema da disposição das amostras na placa pode ser visualizado na Figura 34.

Figura 34 - Esquema da disposição das células na placa de 96 poços. B = controle da solução; VC = controle da viabilidade celular; C1-C8 = diluições da amostra em ordem crescente de concentração (mg/mL).

Em cada um dos 96 poços, foram adicionados 150 μL de DESORB. As placas foram agitadas em agitador de placas por 10 minutos e lidas em leitora de ELISA (BIOTEK, Synergy HT) a 540 nm. A viabilidade celular foi calculada de acordo com a equação (7):

100 ) ( (%)  ODcontrol ODsample VC (7) em que: VC é a viabilidade celular em porcentagem, OD sample é a densidade óptica do extrato, OD control é a densidade óptica do controle de células do teste (OECD 129, 2010).

A leitura das absorvâncias foi realizada em espectrofotômetro de placas (Biotek) no comprimento de onda de 540 nm. Os valores de IC50 foram calculados pelo programa PHOTOTOX® _{(Statistical Software Phototox® Version} 2.0 for OECD Test Guideline 432).

3.4.3 Liberação de Fármaco dos híbridos e compósitos híbridos