Procedimentos de recolha e análise de dados

Les objectifs des différents tests de génotoxicité sont d’une part d’identifier des agents génotoxiques, mais également de déterminer leurs modes d’action moléculaires et cellulaires (bioactivation, nature des interactions avec l’ADN, modifications de bases, cassures de brins, pontages, intercalations, substitutions, addition ou délétion de paires de bases, cassures chromatiniennes ou chromosomiques, pertes de chromosomes entiers…) (Dearfield et al.,2005). Différents tests et stratégies associatives de tests de génotoxicité ont été développés pour évaluer le risque de survenue des trois types de dommages génétiques responsables de pathologies humaines: les mutations géniques (modifications d’une ou de quelques paires de bases dans un seul gène), les mutations chromosomiques de structure (translocations et inversions consécutives à des cassures double-brins directes ou indirectes) et les mutations aneugènes (qui induisent une perte de chromosomes entiers) (Dearfield et al.,2002). Les lésions primaires de l’ADN peuvent être évaluées par le test des comètes, ou par la détection de différents types d’adduits; les mutations géniques par le test d’Ames et le « Mouse lymphom assay », les lésions chromosomiques clastogènes et aneugènes par le test des aberrations chromosomiques ou le test des micronoyaux (Morita et al.,

2009). Chaque test est décrit dans une ligne directrice de l’OCDE.

I-2-1-Test d’Ames

Mis au point par le Pr Ames (Ames, 1975), c’est le plus ancien des tests de toxicologie génétique (Sari-Minodier et al., 2006). Il est utilisé afin de déterminer la mutagénicité et l’anti-mutagénicité à court terme de certains agents et mixtures mutagènes (test de mutagenèse) (Czeczot

et al., 1990).

Différentes méthodes peuvent mesurer le pouvoir mutagène des xénobiotiques, tel que le B[a]P. Certaines méthodes permettent la mesure du pouvoir d'un xénobiotique à redonner le phénotype normal pour certains caractères phénotypiques mutés. Par exemple, les souches de

Salmonella typhymurium (TA100 et T98) dans le test d'Ames ont été préalablement mutées pour devenir auxotrophe à l'histidine. Des mutations subséquentes induites par des xénobiotiques rendent ces dernières phototrophes à l'histidine, leurs conférant ainsi, la capacité de se multiplier dans un milieu dépourvu d'histidine (Maron et Ames, 1983). D'autres tests ayant le même principe de mutations renversées existent, telle SOS chromatest (Quillardet et Hofnung, 1993).Ce test est simple, rapide (48h) et peu coûteux et est largement utilisé par de nombreux laboratoires. Il présente un inconvénient majeur : il repose sur l’utilisation de cellules bactériennes dont le métabolisme diffère des cellules animales et humaines. Or certains composés cancérogènes nécessitent d’être

métabolisés pour être actifs, ce qui signifie que certains composés peuvent être activés dans les cellules bactériennes mais pas dans les cellules animales et/ou humaines et vice-versa. Une modification du test initial a consisté à utiliser un mélange de microsomes hépatiques de mammifères (S9) afin de réaliser l’activation métabolique de certains mutagènes. Néanmoins, malgré le recours aux extraits de foie, le test d’Ames ne détecte qu’environ la moitié des agents des cancérigènes potentiels (Ames, 1975). La figure 2 représente le principe du test d’Ames :

Figure 2 : Principe du test d’Ames (Ames, 1975).

I-2-2-Test du micronoyau

Les micronoyaux sont constitués de chromosomes entiers perdus au cours de la mitose (phénomène aneugène) ou de fragments chromosomiques acentriques exclus du noyau de la cellule fille pendant la division cellulaire (phénomène clastogène). Le test évalue l’exposition à des agents clastogènes et/ou aneugènes. C’est à la fois un test de mutations chromosomiques et de mutations géniques (Schmid, 1975; Eslava, 2004). Les tests des micronoyaux ont émergé comme l'une des méthodes préférées pour l'évaluation des dommages chromosomiques (Fenech, 2000).Cette technique repose sur l’utilisation de cytochalasine B, un inhibiteur de la polymérisation des filaments d’actine nécessaire à la formation de l’anneau de microfilaments qui permet la cytodiérèse. La cellule se retrouve ainsi dans un état binucléé. Les chromosomes lésés par le stress sont incapables de migrer vers les pôles durant la mitose. En télophase, une membrane nucléaire se forme autour prenant l’aspect d’un petit noyau, c’est ce qu’on appelle un micronoyau. Il s’agit alors de comptabiliser le nombre de micronoyaux par cellules binucléées sur un total de 1000 cellules (Berthelot-Ricou et al., 2013). Ce test présente l’avantage de mettre en évidence à la fois les lésions aneugènes (anomalies du nombre des chromosomes) et les lésions clastogènes et constitue un

biomarqueur d’effet précoce qui semble aussi prédictif du risque de cancer. La figure 3 illustre le principe du test de micronoyau :

Effet aneugène : perte de chromosomes entiers. Effet clastogène : perte de fragments de chromosomes

Figure 3 : Principe du test des micronoyaux: Lésion chromosomique au cours de la mitose après exposition de cellules somatiques à un agent génotoxique (Berthelot-Ricou et al.,

2013).

I-2-3-Test d’aberration chromosomique

Ce test se base sur la mise en évidence des différentes aberrations chromosomiques, délétion/fragmentation, (Bouraoui et al., 2011)polyploïdie ou encore, induites au niveau des cellules de la moelle osseuse des souris(rongeurs), par un agent mutagène. Ces aberrations sont détectables, sous microscope optique à la division en bloquant les cellules en métaphase avec la colchicine (inhibiteur du fuseau) (Sierra et Gaivão, 2014). Cet examen se fait au cours de la métaphase de la mitose. La fréquence des aberrations est évaluée sur 200 mitoses par lames de microscope. L’augmentation de la fréquence des aberrations chromosomiques est prédictive de la sur venue de cancers (Bonassi, 1995 ; Hagmar, 1998) parmi ces agents génotoxiques, on note les moutardes azotées dont l’utilité clinique est affectée par leurs effets secondaires incluant le cancer secondaire (Eder et al., 1990).C’est pourquoi la recherche scientifique s’est orientée vers la recherche des molécules actives, à effet thérapeutique à partir des plantes par exemples pour remplacer ces traitements toxiques.

I-2-4-Test de comète

I-2-4-1-Définition et historique

Le test des Comètes ou «Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) Assay» visiblement, très simple, peu couteuse et ne nécessitant pas d'équipement sophistiqué et coûteux, a été le plus largement adapté et utilisé (Osipov et al., 2014).Test d’altérations primaires de l’ADN, en situation alcaline, est défini comme une nouvelle technique micro-électrophorétique rapide, simple et sensible (Ostling et Johanson, 1984), qui permet d'évaluer in vitro et in vivo les cassures d'ADN simple et double-brin et les sites alcali-labiles sur des cellules eucaryotes individualisées (McKelvey-Martin et al.,1993). Ce test permet d'établir la relation dose-effet (Wilkening et al.,2003). Il permet de mettre en évidence les propriétés clastogènes de certains produits génotoxique directement ou indirectement, lors des processus enzymatiques de réparation des dommages ou lors de processus secondaires de défragmentation de l'ADN, tels que l’apoptose (Sierra et Gaivão, 2014). Mais ne peut en aucun cas détecter des mutations. Il peut permettre, dans des conditions particulières, d'évaluer les capacités de réparation cellulaire (Tice et al., 2000).

L’idée originale de ce test revient à Rydberg et Johanson en 1978. Ils furent les premiers à quantifier les dommages à I'ADN dans des cellules isolées de mammifères incluses dans de l’agarose sur lame de microscope. Après lyse de ces cellules en conditions alcalines, permettant le déroulement partiel de la chromatine, et marquages à l'acridine orange, la mesure du rapport fluorescence verte / fluorescence rouge, traduisant le rapport entre les molécules d'ADN double-brin et simple-brin, apportait une information sur l’intégrité du génome et la mesure du degré de dommages à l'ADN. Plus tard, Ostling et Johanson (1984) apportèrent quelques modifications et donnèrent à l’essai son nom de test des comètes. Ils ajoutèrent au protocole une brève étape d'électrophorèse en conditions neutres et optèrent pour une coloration au bromure d'éthidium. Mais cette technique ne permettait que la détection des cassures double-brin (Schwartz et Cantor, 1984).

Il fallut attendre l’introduction d'une électrophorèse en conditions alcalines par Singh et al. (1988) pour pouvoir détecter les cassures simple-brin ainsi que les sites alcali-labiles. Cette version du test des comètes a remporté depuis un vif succès et ses applications se sont répandues à de nombreux types cellulaires. Les différentes étapes du protocole expérimental sont illustrées sur la figure 4 ci-dessous.

Figure 4 : Principales étapes du test des comètes (Rojas et al., 1999).

I-2-4-2-Nature des dommages mis en évidence

On a d’une part les lésions générales d’ADN :

Il y a tout d’abord les adduits encombrants qui correspondent à l’entité chimique résultant de l’établissement d’une liaison covalente entre une molécule chimique électrophile et un site nucléophile d’une base de l’ADN. Les micro-adduits sont ainsi formés par l’alkylation d’une base azotée de l’ADN. Par ailleurs des lésions oxydatives de l’ADN peuvent être générées lors de l’attaque des bases de l’ADN par les espèces réactives de l’oxygène. On peut aussi assister à la formation de sites AP : sites apuriniques ou sites apyrimidiques, sous l'effet des agents alkylants par exemple. Des pertes ou des insertions ou les modifications d’une ou plusieurs bases de l’ADN peut aussi survenir. D’autres types de lésions sont possibles mais apparaissent moins fréquemment lors de l’exposition à des génotoxiques chimiques. Il s’agit des pontages intra ou inter-brins qui correspondent à des liaisons covalentes anormales établies entre les bases de l’ADN. Ou cassures simples et doubles brins générées essentiellement par les rayonnements ionisants (Zeithaml et al.,

1990).

Les dommages directs détectés par le test de la comète :

La conduite des étapes de déroulement de l'ADN et d'électrophorèse à certain pH, dans le test des comètes permet la détection différentielle (Horvathova et al., 1998; Menke et al., 2001; Wozniak et Blasiak, 2003)

- des cassures double-brin à pH < 9,0

- des cassures simples et double-brin du fait de la dénaturation des liaisons Hydrogène de la double hélice d’ADN à pH < 12,1

- des cassures simple et double-brin et d'une majorité de sites alcali labiles à pH>13.

Une cellule subit, à tout moment, des agressions physiques et chimiques d'origine exogène. L'ADN en est la cible privilégiée. La fixation covalente d'un produit au niveau de l'ADN peut provoquer des lésions ou des mésappariements à l'origine de modifications de sa structure. Les altérations possibles de l'ADN provoquées par les facteurs exogènes sont multiples et diverses.

a- Les cassures simples et double-brin -Les cassures simple-brin

Il s'agit d'une cassure sur un des deux brins du squelette phosphodiester de l'ADN. Il existe un grand nombre d'agents (exogènes) capables de rompre les liaisons phosphodiesters. Parmi eux on trouve des agents chimiques comme les peroxydes ou encore certains ions métalliques (Fe⁺², Cu⁺²).Les radiations ionisantes produisent également des cassures, par l'action d'électrons secondaires, par l'ionisation de l'eau et la production de radicaux libres oxygénés qui sont capables d'attaquer ces liaisons (Freifelder, 1990).Les cassures simple-brin surviennent également et même fréquemment au cours de processus endogènes. Elles sont le résultat de nombreuses réactions différentes, telles que par exemple:

*la réparation par l'excision de bases ou de nucléotides, *l'action d’endonucléases ou de la topoisomérase I.

Les cassures simple-brin sont considérées comme des lésions réparables étant donné que le brin opposé de la double hélice maintient les deux extrémités du brin cassé proches. Les cassures simple-brin sont le plus souvent réparées par l'action de l'ADN ligase. Certaines de ces cassures peuvent être réparées rapidement parce qu'elles représentent de simples discontinuités (entre un 5'-phosphate et un 3' -hydroxyl) dans le squelette phosphodiester de l'ADN .En revanche, d'autres cassures sur un 3'-phosphate nécessitent comme première étape de réparation une déphosphorylation (Eastman et Barry, 1992).

- Les cassures double-brin

Elles sont définies comme la présence de deux cassures, chacune sur un brin opposé du double hélice, localisées soit en opposition soit proche l'une de l'autre, entraînant la rupture de la double hélice. Si une molécule d'ADN comporte un nombre important de cassures simple-brin, elles peuvent se situer de façon suffisamment proche pour former une cassure double-brin.

Des cassures double-brin peuvent être produites lors de divers processus endogènes physiologiques, tels que la transcription, la recombinaison, la réplication, certains types de réparation de l'ADN, ou l'apoptose. Les facteurs exogènes responsables les plus courants sont les radiations ionisantes, les inhibiteurs de la topoisomérase II, les xénobiotiques générant des radicaux libres ou oxygénés.

Une cassure double-brin de l'ADN est une lésion qui peut conduire à une perte importante d'informations pour la cellule, à cause de la discontinuité physique du chromosome qui en résulte. Une non-réparation ou une réparation fautive d'une cassure double-brin conduira à une aberration chromosomique, à une mortalité cellulaire ou à une transformation oncogénique (Eastman et Barry, 1992).

b- Les sites alcali-labiles

Les cassures ne sont pas toutes induites directement, certains sites fragilisés peuvent être transformés en cassure de brin lors du traitement de l'ADN avec des solutions très alcalines (pH>13). Ces sites peuvent être formés par les agents alkylants. En effet ces derniers forment des liaisons sur les sites nucléophiles de l'ADN, illustrés figure 5.

Figure 5 : Sites d'alkylation des bases de l'ADN (Friedberg, 2005).

Les agents alkylants vont ainsi affaiblir la liaison N-glycosidique, ce qui va conduire à la dépurination ou à la dépyrimidination spontanée, formant des sites apuriques ou apyrimidiniques encore appelés sites AP figure 6 :

Figure 6: Exemple d'un site AP (Friedberg, 2005).

Ces sites AP peuvent également résulter de l'excision de certaines bases endommagées initiée par une ADN-glycosylase spécifique (Friedberg et al., 1995). Notons que ces sites alcali-labiles sont stables jusqu'à des pH de 12,5(Eastman et Barry, 1992). Au-delà, les sites AP sont hydroxylés par une réaction de p-élimination produisant un clivage de la liaison phosphodiester et donc une cassure de brin.

Outre les cassures de brins et les sites alcali-labiles, cette technique permet la détection indirecte des lésions telles que les adduits ou les ponts intra-brins, parce qu'ils ralentissent la migration de l'ADN dans le champ électrophorétique (Pfuhler et Wol, 1996 ; Horvathova el al.,

1998) ou via l’intervention des systèmes de réparation par excision-resynthèse (Speit et Hartmann,1995). Théoriquement le test des comètes peut mettre en évidence l'action des radiations, des mutagènes directs, des pro-mutagènes des agents alkylants, des intercalant et des dommages oxydatifs. En 1998, plus de 212 produits avaient été testés sur différents types cellulaires (Anderson

et al., 1998). Cet essai permet également de détecter les processus apoptotiques qui se traduisent par des coupures régulières à chaque nucléosome de l’ADN nucléaire (Olive et al., 1993 ; Steinert, 1996).

Dans le cas de l'apoptose les comètes formées sont alors atypiques et caractéristiques quelquefois qualifiées de cellules <<fantômes> ou cellules < hérissons>Des travaux récents contestent cependant que ces observations correspondent à des cellules apoptotiques (Rundell et al., 2003 ; Meintières el al., 2003).

I- 2-4-3- Le principe général de test de comète

A l'état normal, une molécule d'ADN située dans le noyau se présente sous une forme super-enroulée. Une cassure provoque la rupture du brin d'ADN; cela entraîne un relâchement de cette structure en double hélice. Sous l'effet d'un champ électrique faible, les fragments d'ADN, plus légers et surtout chargés négativement, vont migrer vers l'anode (Tice et al., 2000).

Le protocole suit les étapes :

a- Les cellules

Toute cellule eucaryote peut être employée pour la réalisation du test des Comètes à condition d'obtenir une suspension homogène de cellules bien individualisées avec une viabilité acceptable, i.e.>60% (Fairbairn, 1994).

La préparation de la suspension cellulaire à partir d'une culture (in vitro) ou d'un organisme (in vivo), constitue la première étape du test; Elle peut se révéler très délicate, car elle constitue la base du test et conditionne son bon déroulement. Il est indispensable de manipuler les cellules avec d'extrêmes précautions, afin de ne pas engendrer de lésions supplémentaires non spécifiques de l'ADN. C'est pour cette raison en particulier que certaines étapes du test se déroulent à l'obscurité, la lumière naturelle (les rayons UV en particulier) pouvant induire des lésions alcali-labiles supplémentaires (Tice et al., 2000 ; Hartmann et al., 2003).

En ce qui concerne le traitement ou l'exposition par les substances à étudier, le principe consiste à : Pour le protocole in vivo : exposer l'organisme vivant à la substance à tester, récupérer les tissus et/ou les échantillons biologiques d'intérêt et d'en isoler les cellules. La technique d'isolement cellulaire doit permettre de récupérer un nombre suffisant de cellules (> 1.105) viables (Anderson et al., 1998).

b- La préparation des lames

Le principe du test des Comètes consiste à inclure la suspension de cellules individualisées ainsi obtenue dans un gel d'agarose à bas point de fusion (37 ᵒC), l'ensemble étant déposé sur des lames de microscopie la suspension cellulaire ainsi obtenue dans un gel d'agarose à bas point de fusion (37 ᵒC), l'ensemble étant déposé sur des lames de microscopie. Ce mélange cellules-agarose est inclus « en sandwich» entre deux autres couches de gel d'agarose

La préparation des lames et surtout celle des agaroses (à bonne concentration) constitue également une étape importante et délicate du test.

c- La lyse

Lorsqu'une cellule est soumise à une solution de lyse contenant un détergent, non ionique ou ionique, et contenant des sels en concentration élevée, le détergent rendra la cellule perméable en dissociant la double couche de phospholipides membranaires, tandis que la solution saline

dissociera les histones de l'ADN soit plus de 95% des protéines nucléaires (Fairbairn et al.,

1995).En effet la chromatine se dissocie en présence de solutions salines à concentrations élevées. Notons que la solution de lyse ne doit en aucun cas endommager le gel d'agarose.

Un antioxydant, le diméthylsulfoxyde (DMSO) sera ajouté à 10 % pour prévenir la formation des radicaux oxygénés pouvant provenir de l'hémoglobine libérée par les érythrocytes éventuellement présents dans le(s) tissu(s) (Tice et al., 2000). De cette façon, bien que la plupart des auteurs préconisent une durée d'une heure, temps minimum pour lyser la membrane cytoplasmique, la lyse pourrait être prolongée pendant des mois sans provoquer de lésions supplémentaires.

Lors de cette étape, les membranes cellulaires, nucléaires, et les protéines liées à l'ADN sont éliminées. En revanche, à ce stade du protocole la structure de l'ADN persiste sous forme super-enroulée, malgré l'absence de la membrane du noyau et l'élimination des histones, et ce du fait de la présence de la matrice nucléaire.

d- La dénaturation

Cette étape permet alors le relâchement de la molécule d'ADN suivi par son déroulement et par la dénaturation de l'ADN double-brin, c'est-à-dire la séparation des deux brins; l'ADN devient alors simple-brin ou monocaténaire.

L'augmentation de pH est un agent dénaturant car il modifie les charges portées par les groupements chimiques engagés dans les liaisons hydrogènes qui maintiennent la structure en double hélice. Le déroulement se produit au niveau des extrémités de la molécule d'ADN mais aussi au niveau des cassures simple-brin. Notons à ce sujet que si l'ADN super-enroulée présente une cassure simple-brin, il en résulte un relâchement de la double hélice super-enroulée. Ainsi une molécule d'ADN portant une cassure est beaucoup moins compacte.

En conclusion, la réalisation de cette étape permettra la mise en évidence des cassures simple et double-brin et des sites alcali-labiles (Miyamae et al., 1997).

e- L'électrophorèse

L'ADN chargé négativement, soumis à un champ électrique, va migrer vers l'anode. Les fragments d'ADN beaucoup plus légers seront entraînés plus loin, formant ainsi une traînée, la queue de la comète.

L'électrophorèse est, comme la dénaturation, réalisée à pH alcalin (pH > 13), pendant 20 minutes, à 25 V et 300 mA. Ainsi les fragments d'ADN vont migrer dans le gel selon leur taille. *Selon Singh (Singh et al., 1991), la tension utilisée doit être la plus faible possible permettant de faire migrer des molécules d'ADN de poids moléculaire élevé.

*Tice (Tice et al., 2000) recommande une réalisation à + 4ᵒC pour garantir une bonne reproductibilité.

*Speit (Speit et al., 1995) montre que la température de l'électrophorèse est un paramètre majeur et peut engendrer d'importantes variabilités dans les résultats.

f- La neutralisation

Après l'électrophorèse, il est recommandé de rincer les lames dans un tampon à pH=7,4. Cette étape a pour but de neutraliser la solution alcaline présente dans le gel et d'éliminer les sels et les détergents qui entraîneraient lors de la lecture un bruit de fond important (Singh, 1996).

g- La coloration

Les lames peuvent être lues en l'état immédiatement, une fixation à l'alcool permet de les conserver à température ambiante et à l'abri de la lumière (Klaude et al., 1996 ; Woods et al., 1999).