Procedimentos experimentais

Todos os testes comportamentais descritos abaixo foram registrados através de um sistema de câmera/vídeo (DVD), o qual permitiu a gravação de todos os experimentos para uma posterior análise dos dados. Os experimentos foram realizados em dois períodos distintos, com ínicio por volta das 7-8h, durante o dia (fase clara e inativa dos animais), ou iniciando entre 19-20 h, durante a noite (fase escura e ativa dos roedores). A escolha dos animais para cada tratamento seguiu uma ordem aleatória.

Em todas as sessões os animais foram retirados do Biotério do Laboratório de Neuropsicofarmacologia e levados para a sala de experimentação 30-45 min antes do início do procedimento experimental, visando uma ambientação ao local no qual os testes foram realizados. A sala de ambientação foi suavemente iluminada por um lâmpada incandescente de 40 lux para experimento durante o dia ou 4 lux para experimentos realizados durante a noite, a temperatura nessa sala foi mantida em torno de 20oC ± 1oC, através de uma aparelho de ar- condicionado. Os experimentos foram conduzidos em uma sala conjugada com iluminação (40 lux para todos os experimentos) e temperatura controlada.

3.4.1 Condicionamento de Medo Contextual

Os experimentos de condicionamento de medo contextual foram realizados em uma caixa de condicionamento (Insight Ltda, SP, Brasil) dotada de piso gradeado conectado a um gerador de choque elétrico (Figura 13), sendo a amplitude e o tempo do choque configurado previamente dependendo do grupo experimental e do objetivo do estudo.

Figura 12. Caixa de condicionamento

O modelo de condicionamento de medo contextual utilizado é baseado no modelo de condicionamento clássico desenvolvido por Ivan Pavlov. Como descrito na figura 16, o referido procedimento experimental foi desenvolvido em várias sessões. No primeiro dia, os animais foram expostos por 3 min à caixa de condicionamento em um processo chamado familiarização, tendo como objetivo o reconhecimento do aparato experimental (FANSELOW, 1990). Discute- se que os animais precisam de um tempo de exploração ao contexto (2-3 min) com objetivo de formar uma representação interna desse contexto. Isso só seria necessário durante um condicionamento de medo contextual e a ausência dessa sessão de familiarização impede a contextualização do evento aversivo (FRANKLAND et al., 2004; LANDEIRA-FERNANDEZ et al., 2006; RIEBE et al., 2012). Após a sessão de familiarização, animais foram retirados e levados para uma caixa permanência até o fim de todo o experimento quando todos foram reagrupados, em suas respectivas caixas moradias, e levados novamente ao biotério. No dia seguinte, os animais passaram pela sessão de condicionamento na qual foram expostos a caixa de condicionamento e após 30 s receberam 3 choques de 0,7 mA por 3 s nas patas com intervalo entre os choque de 30 s, após os choques animais permaneceram por mais 30 s nesse aparato experimental.

O teste comportamental consistiu em re-expor o animal à caixa de condicionamento (contexto A) no teste A1 (dia 3) em uma sessão de 3

min, visando avaliar o comportamento de medo condicionado apresentado pelo animal. A resposta comportamental avaliada foi a resposta de congelamento (em porcentagem de tempo), que foi definido por Blanchard e Blanchard (1969) como imobilidade em uma posição de agachamento, com ausência total de movimentos com exceção dos movimentos necessários para a respiração, sendo considerado um comportamento de medo condicionado (FANSELOW, 1980).

No dia 4, animais foram expostos a uma caixa de vidro, totalmente diferente do contexto no qual o animal foi condicionado (contexto neutro, Contexto B, figura 14). A exposição ao contexto B durou 3 min, sendo chamada de teste B1, com objetivo de avaliar a

generalização da memória de medo, ou seja, se o animal passa a apresentar congelamento significativo em um contexto neutro, que não possui nenhum grau de aversividade.

Figura 13. Contexto B. Caixa de vidro.

Com objetivo de investigar a persistência da memória de medo formada, foi realizada uma segunda sessão de teste A (teste A2 – 3 min),

uma semana após o condicionamento, e no dia seguinte uma segunda sessão de teste B (teste B2 – 3 min), a fim de avaliar a durabilidade da

memória associativa e/ou generalização do medo. 48 h após o teste B os animais foram expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE). Após cada exposição, os aparatos experimentais foram limpos com solução de etanol (10% v/v).

3.4.2 Labirinto em Cruz Elevado (LCE)

O labirinto em cruz elevado foi realizado com objetivo de investigar a ocorrência do processo de sensibilização do medo. O processo de sensibilização da memória é considerado um aprendizado não associativo, ou seja, um aumento da resposta de medo a um estímulo que é aversivo, embora não esteja associado à memória de medo (RIEBE et al., 2012).

O LCE (figura 15) um teste que consiste em um aparato de MDF branco (EP-151, Insight, SP, Brasil), com quatro braços, sendo dois abertos, de 50 x 10 cm, com uma proteção de 1 cm de altura em todo o braço e dois fechados, com medidas de 50 x 10 x 40 cm, disposto de maneira oposta e uma plataforma central (10 x 10 cm).

Os animais foram colocados na plataforma central do labirinto com a cabeça voltada para os braços fechados e exploraram livremente durante 5 minutos, ao fim da sessão animal foi retirado e levado para um caixa permanência até o fim de todo o experimento quando todos foram levados em suas respectivas caixas moradias, novamente ao biotério. Após cada exposição, o labirinto foi limpo com solução de etanol (10% v/v). Os seguintes parâmetros foram avaliados:

- Números de entradas nos braços abertos (EA) do LCE, considerados apenas quando animal colocava as quatro patas em um dos braços abertos.

- Número de entradas nos braços fechados (EF) do LCE, consideradas apenas quando animais colocavam as quatro patas em um dos braços fechados.

- Tempo de permanência nos braços abertos (TA) do LCE, considerado desde a entrada do roedor no braço aberto até que uma das patas fosse colocada em outra parte do LCE.

- Tempo de permanência nos braços fechados (TF) do LCE, considerado desde a entrada do rato no braço fechado até que uma das patas fosse colocada em outra parte do LCE.

- Postura de estiramento (PAR), comportamento relacionado à avaliação de risco, e foi registrado o número de tentativas de entradas nos braços abertos, considerada quando o animal colocou pelo menos uma das patas em um dos braços abertos e voltou à posição original.

Os dados desses parâmetros foram usados para calcular a frequência de ocorrência de determinado comportamento. São eles, a porcentagem de tempo nos braços abertos {%TA; [(tempo nos braços abertos/300) x 100] e a porcentagem de entradas nos braços abertos {%EA; [número de entradas nos braços abertos/número total de entradas (aberto + fechado) x 100]. Os outros parâmetros são plotados na forma bruta.

Figura 15. Representação esquemática geral do protocolo experimental

utilizado durante a realização dos experimentos comportamentais. 3.4.3 Dosagem de corticosterona plasmática

A dosagem de corticosterona foi realizada pelo método de quimiluminescência. O seguinte protocolo foi adotado para a coleta de amostra de sangue destinado a posterior dosagem de corticosterona plasmática: animais foram sacrificados por decapitação, utilizada uma guilhotina e cerca de 4 ml de sangue foi coletado e separado em 2 eppendorfs , um deles encaminhado para posterior análise e outro armazenado em freezer -80 oC caso fosse necessária a realização de uma nova análise, evitando assim o sacrifício de outros animais. As análises foram realizadas pelo Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias – Petlabor®.

Para avaliar a concentração basal de corticosterona durante o dia ou noite os animais foram divididos em dois grupos, retirados do biotério aproximadamente às 7h e 30 min ou às 19h e 30 min e levados à sala de perfusão, não sendo submetidos a nenhum procedimento experimental e nenhum tratamento, e foram decapitados conforme o experimento já explicado. O protocolo utilizado para avaliar o efeito do condicionamento sobre a liberação de corticosterona foi o seguinte: animais passaram por uma sessão de condicionamento (3 choques de 0,7 mA/3s) durante o dia ou noite e após 30 min, período necessário para se alcançar concentração plasmática elevada de corticosterona após uma situação de estresse e foram sacrificados como descrito acima.