Procedimentos experimentais

Nessa etapa do estudo foram realizados dois experimentos, conduzidos entre 8:00 h e 12:30 h, para evitar flutuações nos níveis plasmáticos de corticosterona em função do ritmo circadiano.

3.1.5.1 Experimento 3A - Determinação do perfil de secreção de corticosterona em camundongos submetidos ao teste de exposição ao rato (RET).

Os experimentos foram realizados durante cinco dias consecutivos e consistiram em duas fases: habituação e teste de exposição.

Fase 1 - Habituação

Antes do início do teste, os camundongos foram transportados para uma sala adjacente

à sala de experimento, onde permaneceram por um período de 1 hora para ambientação. Posteriormente, os animais foram conduzidos até a sala experimental e colocados individualmente na superfície da caixa de exposição por um período de 10 minutos para livre exploração do aparato sem a presença do rato. A maravalha da caixa moradia de cada animal foi colocada nos compartimentos superfície e toca para facilitar a habituação. Esse procedimento foi repetido por 4 dias consecutivos com a finalidade de reduzir o potencial

Fase 2 - Teste de Exposição

No quinto dia, um rato macho Long-Evans pesando aproximadamente 600 g (predador) e tratado com apomorfina (3 mg/kg, s.c., para mantê-lo em movimento durante o teste) foi introduzido no compartimento do predador. A maravalha da caixa moradia de cada animal foi novamente colocada nos compartimentos superfície e toca. Em seguida, cada camundongo foi transportado com auxílio de uma gaiola individual até a sala experimental e, colocado na superfície do aparato, compartimento que o separava do rato, por um período de 10 minutos. Ao final da exposição, os animais retornaram a sala adjacente à sala experimental, onde foram mantidos isolados por 5, 20 ou 50 minutos em gaiolas viveiro individuais contendo maravalha da caixa moradia original. Transcorridos esses períodos, os animais foram levados a uma outra sala experimental, aonde foram decapitados e a coleta do sangue do tronco foi realizada em tubos de polipropileno previamente heparinizados. Além disso, três grupos adicionais de camundongos experimentalmente ingênuos foram colocados individualmente em gaiolas viveiro contendo maravalha de suas caixas moradia originais e mantidos isolados por 5, 20 ou 50 minutos. O mesmo procedimento de decapitação e coleta de sangue descrito acima foi utilizado para esses últimos animais. Posteriormente à coleta, o

sangue foi centrifugado a 11.500 rpm (por 10 minutos e a 4o_{C) e o plasma foi separado e}

estocado a -80 ºC até o dia em que foi realizada a dosagem de corticosterona. O protocolo experimental do experimento 3A encontra-se ilustrado na Figura 2.

Figura 2 - Representação esquemática do protocolo experimental utilizado no experimento 3A. O aparato RET foi modificado de Yang et al. (2004).

Decapitação Toca Túnel Superfície Tela de arame Habituação Toca Túnel Superfície Tela de arame Teste de exposição

Habituação - 4 dias consecutivos por 10 min

Teste - 5o _dia

Exposição ao rato por 10 min

5 min 20 min 50 min

Coleta do plasma

Decapitação

5 min 20 min 50 min

Coleta do plasma GRUPOS CONTROLE

3.1.5.1.1 Radioimunoensaio para Corticosterona

A concentração plasmática de corticosterona foi determinada por radioimunoensaio (RIE) segundo o método utilizado por Marin, Cruz e Planeta (2007), adaptado de Sarnyai et

al. (1992). O anticorpo para corticosterona liofilizado da Sigma® (St. Louis, MO) foi

ressuspenso em 5 ml de Tampão Tris pH 8,0 (0,05M Tris-HCl; 0,1M NaCl; 0,1% de Azida Sódica) e separado em alíquotas (solução estoque) e conservado a –20º C até a utilização. Para a realização do ensaio a solução estoque foi diluída em tampão Tris na proporção de 1:2.

Alíquotas de 20 μl de plasma dos camundongos foram adicionadas a 980 μl de tampão fosfato e incubadas em banho de água a 75 ºC durante 1 hora para deslocamento da corticosterona ligada à globulina plasmática. Após a incubação, as amostras foram resfriadas à temperatura ambiente e alíquotas de 100 μl foram transferidas para tubos de polipropileno

contendo 100 μl da solução 1:2 do anticorpo para corticosterona e [3_{H]-corticosterona (10.000}

– 20.000 cpm por tubo de ensaio). As amostras foram incubadas por 12 - 18 horas a 4º C.

Após a incubação, a [3H]-corticosterona não ligada foi removida adicionando-se 500 μl de

solução de carvão ativado e dextran, seguido de centrifugação a 10.000 rpm por 10 minutos a 4ºC. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para vials contendo líquido de cintilação e a radioatividade foi determinada em espectrofotômetro de cintilação líquida.

A curva padrão foi construída com concentrações de corticosterona (Sigma®) de 1000;

500; 250; 125; 62,5 e 31,25 pg/dl, em triplicatas. Após a diluição, todas as concentrações de corticosterona das amostras encontraram-se dentro do intervalo de linearidade da curva padrão. O limite de detecção foi de 0,23 μg/dl e os coeficientes de variação inter e intraensaio foram de 4,0% e 8,1%, respectivamente.

3.1.5.2 Experimento 3B - Determinação da concentração plasmática de corticosterona e avaliação dos comportamentos defensivos de camundongos expostos aos ratos de brinquedo ou verdade no RET.

O protocolo experimental desta etapa do estudo foi semelhante ao descrito para o Experimento 3A (página 41). Os experimentos também foram realizados durante cinco dias consecutivos e consistiram na habituação e no teste de exposição.

No dia do teste, os camundongos foram alocados em dois grupos, um exposto ao rato Long-Evans (predador) e outro, exposto a um rato de brinquedo no RET por 10 min. Ao final da exposição, os animais retornaram a sala adjacente à sala experimental, onde foram mantidos isolados por 5 minutos em gaiolas viveiro individuais contendo maravalha da caixa moradia original. Ao final desse período, os animais foram levados a uma outra sala

experimental aonde foram decapitados e a coleta do sangue do tronco foi realizada em tubos de polipropileno previamente heparinizados. De acordo com os resultados observados no experimento 3A, foi demonstrado que o pico de secreção plasmática de corticosterona em camundongos ocorreu após 5 min do final da exposição ao rato (predador) no RET (ou 15 minutos contabilizados desde o início da exposição ao rato no RET). Diante disso, a coleta de sangue dos animais para o experimento 3B, foi realizada após 5 min do final do teste.

Um grupo adicional de camundongos experimentalmente ingênuos foi utilizado como controle e os animais foram individualmente expostos a uma gaiola viveiro contendo maravalha de sua caixa moradia original por 5 min.

Os experimentos dessa etapa foram gravados através de um circuito fechado filmadora-TV-DVD para análise posterior. Os parâmetros comportamentais registrados durante o teste de exposição ao rato foram avaliados com o auxílio do programa Hindsight, desenvolvido por Scott Weiss e compreenderam medidas espaço temporais (frequência de entradas e tempo na toca, túnel e superfície) e etológicas. O tempo gasto em contato com a tela de arame, incluindo sua escalada, foi registrado como tempo total de contato. As medidas etológicas avaliadas foram: freqüência e duração de avaliação de risco (animal estica o corpo sem movimentar as patas traseiras e volta a posição inicial ou movimenta-se com corpo esticado) na toca, túnel ou superfície, tempo total de congelamento (definido como ausência de movimentos que não os da respiração), de ocultação defensiva (o camundongo empurra com as patas anteriores a maravalha da toca em direção ao túnel) e do comportamento de autolimpeza.