Procedimentos gerais

3.6.1.1. Preparação e Padronização do Inóculo para teste de MIC (Concentração Mínima Inibitória) pelo Método da Microdiluição.

1. Preparar meios de cultura em tubos inclinados para manutenção das culturas.

2. Repicar no meio sólido correspondente ao microrganismo, identificar a cepa e colocar em estufa para crescimento durante 24 horas. Para bactérias 36 a 37o C e leveduras a 30o C.

3. Preparação do inóculo: Depois de 24h de incubação, retirar uma pequena quantidade de células com a alça de platina e passar para um novo tubo, previamente estéril, contendo 5mL de solução salina a 0,9%. Deve-se esfregar na parede do tubo a alça contendo as células. O tubo contendo a cultura de 24h deve ser fechado com tampa de borracha estéril e guardado em geladeira identificado.

4. Agitar com um vortex, e retirar do tubo com as células em suspensão, com uma pipeta estéril, uma alíquota de 2mL desta suspensão (este tubo não precisa ser estéril). Portanto, um tubo permanecerá estéril com 3mL de suspensão celular e, outro com 2mL que não precisa ser estéril, pois será usado para leitura em espectrofotômetro de luz visível.

5. Atenção: Sobrará 3mL de suspensão estéril que posteriormente será utilizada nos testes e que deverá ser armazenado dentro da capela de fluxo. Este tudo deve permanecer identificado e fechado.

6. Padronização do inóculo: Ligar o aparelho, colocar no comprimento de onda de 550nm e calibrar com solução salina (branco ou padrão) até zerar (0,0000). Levar o tubo contendo os 2mL de inóculo ao espectrofotômetro para realizar a leitura. (Agitar

em vortex e colocar numa cubeta para leitura). Anotar a concentração inicial presente em 2mL.

Se necessário, fazer diluição com solução salina 0,9% e anotar o quanto foi usado para chegar na concentração ideal de células. Esta concentração está na tabela em anexo. Que corresponde à escala 0,5 de MacFarland, e possui 108 cél/mL. Proceder da mesma forma para os outros microrganismos

7. O cálculo será realizado da seguinte forma:

Em 2mL de inoculo inicial, usei X mL de salina para ficar 108cél/mL. Em 3mL restantes (estéril) usarei Y mL de salina para ficar 108cél/mL.

8. Na capela de fluxo, realizar a diluição dos 3mL restantes (estéril) de acordo com os cálculos citados acima, a fim de deixa-lo a 108 cél/mL.

9. Depois realizar a diluição até 104,cél/mL, onde será usada para os testes de MIC

10. Em tubos de ensaio estéreis, colocar 9,90mL de meio de cultura em caldo, ou solução salina 0,9%. Seguir os passos:

a) Agitar em vortex o tubo contendo o inóculo padronizado 108cel/mL, tomar 100uL do mesmo, e colocar no tubo com 9,90mL de solução e agitar no vortex. Este tubo passará a ser 106cél/mL.

b) Agitar no vortex o tubo 106 cél/mL, tomar 100uL deste e colocar em outro tubo com 9,90mL de solução e agitar, este tubo conterá 104 cél/mL , que será usado nos testes de MIC.

c) Em cada poço da placa de Elisa usar 100uL do inóculo 104cél/mL.

11. No caso das cepas de E. coli (ETEC, EPEC, EIEC e STEC), deve-se repicá-las em

12. Retirá-las do tubo de 24h e repicar para caldo Müller Hinton enriquecido com peptona ou para Caldo Nutriente, de acordo com as exigências testadas anteriormente para cada cepa. Deixar fermentando por 24h em shaker sob agitação de 180 RPM a 36o C.

13. Depois de 24h, retirar uma alíquota do fermentado e proceder da mesma forma descrita acima para padronização do inóculo.

14. A leitura em espectrofotômetro é feita a 550nm e a ABS deve estar em 0,300.

15. Anotar a diluição feita até chegar a 0,300 e na capela de fluxo realizar, assepticamente as diluições posteriores.

16. O inóculo 108 deve ser diluído para 107 da seguinte forma:

a) Em um tubo estéril adicionar 9,0mL de solução salina ou meio de cultura liquido.

b) Agitar em vortex o tubo 108 e retirar 1mL de inóculo e transferir para o tubo

contendo 9,0mL de liquido.

c) Este tubo passara a ser 107, usar 5uL em cada poço da placa de Elisa.

17. Os tubos com a suspensão celular 108 podem ser guardados em geladeira durante 7 dias. E se necessário, utiliza-lo para preparação de novas diluições no período de 7 dias.

3.6.1.2. Esquema de preparação e diluição do inóculo para bactérias retirar alíquota de 2mL para leitura (não necessita de esterilidade) 3mL fica reservado para posterior diluição leitura em espectrofotômetro a 550nm e acertar diluição para

108 cél/mL ajustar os 3mL restantes de acordo com a leitura em espectrofotômetro para 108cél/mL Diluição 106cél/mL 9,90mL salina e 100uL de inóculo 108cél/mL Diluição 104cél/mL 9,90mL salina e 100uL de inóculo 106cél/mL

agitar com vortex

agita r com vortex tubo contendo 5mL de solução salina 0,9%. tubo inicial com

a cepa de microrganismo

tubo contendo meio de cultura sólido específico para a cepa

repique cultura encubada por 24h 2mL _3mL 5mL 108 106 ₁₀4 Usar 100uL na placa de Elisa 104

3.6.1.3. Esquema de preparação e padronização de inóculo das cepas de E. coli. (ETEC, EPEC, EIEC e STEC)

retirar uma aliquota para leitura em espectofotômetro 550nm 0,300 ABS 108 ajuste do inóculo para 108cél/mL transferir alças de células praum

erlenmeyer contendo 20mL de caldo para

fermentação tubo inicial com

cepa de E. coli

tubo contendo meio de cultura sólido

Mac Conkey cultura encubada por 24h encubação por 24h em shaker 36oC 180 RPM

diluição com caldo

calibrar o aparelho com

o meio de fermantação

agitar com vortex

108 agitar com vortex UTILIZAR 5uL NA PLACA DE ELIZA Diluição 107cél/mL 9,0mL salina e 1000uL (1mL) de inóculo 108cél/mL 107

Figura 53. Preparação e padronização de inóculo das cepas de E. coli.