Procedimentos gerais para os testes

Os antifúngicos fluconazol (FCZ), voriconazol (VCZ) e itraconazol (ITZ), usados nos quatro protocolos foram doados em forma de pó p.a. pelos respectivos laboratórios fabricantes: Laboratórios Pfizer, NY e Janssen-Cilag, NY. De cada droga foi preparada uma solução-mãe, de acordo com a publicação M27-A2 do CLSI (NCCLS, 2002), distribuída em alíquotas e congelada à -70º C. Todas as diluições foram preparadas a partir da solução-mãe de cada antifúngico em meio RPMI-1640 (pH 7,0 e pH 5,0). O antifúngico FCZ, sendo hidrosolúvel, foi diluído em água; ITZ e VCZ foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO).

Utilizou-se o seguinte cálculo para o preparo da solução-mãe de cada droga:

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Peso mg: volume desejado x concentração da solução mãe potência da droga (µg/mL)

Para fluconazol pesou-se 153,6 mg da droga e dissolveu-se em 30 mL de solvente e para itraconazol e voriconazol, pesou-se 48 mg de cada droga e dissolveu-se em 30 mL do solvente. As soluções-mãe tiveram as seguintes concentrações: fluconazol 5120 µg/mL, itraconazol e voriconazol 1600µg/mL. Colocou-se 1,8 a 2,0 mL de cada uma dessas soluções, em flaconetes e armazenou-se em freezer (-70˚C) durante período máximo de seis meses, para preparação futura de soluções de uso.

As concentrações finais usadas nos testes foram preparadas em tubos de ensaio a partir dos flaconetes de soluções-mãe, sendo: 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25 µg/mL para FCZ e 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.06, 0.03 µg/mL para itraconazol e voriconazol (NCCLS, 2002). As soluções contendo as concentrações finais foram dispensadas em reservatórios em V, para pipetagem e preenchimento de placas de microdiluição com auxílio de pipeta multicanal com 8 canais. Foi usada uma placa (Evergreen, EEUU) de 96 orifícios e fundo plano para cada antifúngico. Dispensou-se, da menor para a maior, as 10 concentrações finais de cada antifúngico no sentido das colunas, ou seja, nos poços das colunas 11 a 2. Assim, 100µL da menor concentração de antifúngico foram dispensados nos oito poços da coluna 11, 100µL da concentração seguinte foram dispensados nos poços da coluna 10 e assim sucessivamente, até a maior concentração nos poços da coluna 2. Nas colunas 1 e 12 não se colocou antifúngico desde que foram utilizadas, respectivamente, para controle-negativo ou de esterilidade da placa (CE) e controle-positivo de crescimento (CC) de cada amostra de levedura (QUADRO 1 e FIGURA 1). Após a dispensação das diversas soluções, vedou-se as placas com película adesiva (Axigen, EEUU) e tampa plástica estéril e armazenou-se em freezer a -70˚C por período de até seis meses.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

QUADRO 1. Esquema das concentrações (µg/mL) de antifúngicos nos orifícios das colunas de placas de microtitulação, usadas para testes de sensibilidade por método de microdiluição.

Colunas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

ITZ, VCZ CE 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 0,015 CC FCZ CE 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 CC ITZ: itraconazol; VCZ: voriconazol; FCZ: fluconazol; CE: controle-negativo ou esterilidade; CC: controle-positivo ou crescimento

FIGURA 1. Placa de microtitulação usada para testes de sensibilidade por método de microdiluição.

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Para o teste de sensibilidade, as placas foram descongeladas à temperatura ambiente e adicionados os inóculos de cada amostra de

Candida tropicalis. O preparo do inóculo e dos controles de qualidades foi realizado utilizando-se culturas puras em ágar Sabouraud sem cloranfenicol de 24h sob 35ºC.

Como controles internos de qualidade e de atividade das drogas antifúngicas, foram utilizadas duas cepas-padrão a saber: Candida krusei

(ATCC 6258) e Candida parapsilosis (ATCC 22019), respectivamente, resistentes e sensíveis a fluconazol. Os valores de MIC pelos protocolos EUCAST e CLSI para todas as drogas são conhecidos na literatura (Barry et al.,2000; EUCAST, 2002; Cuenca-Estrella et al., 2007).

Com auxílio de alça descartável estéril, ressuspendeu-se 1 a 5 colônias de cada levedura, em tubo contendo 5 mL de solução fisiológica estéril. Homogeneizou-se e ajustou-se a turbidez àquela equivalente ao da escala 0,5 de McFarland com auxílio de cartão de Wickerhan, correspondendo à concentração de 1x10⁶-5x10⁶ ufc/mL.

A partir deste ponto os procedimentos foram realizados segundo metodologia EUCAST, utilizando-se pH 7,0 e pH 5,0 e método de referência CLSI (NCCLS, 2002; Cuenca-Estrella et al., 2003; EUCAST, 2002), também sob pH 7,0 e 5,0.

Para os testes de sensibilidade, o inóculo inicialmente preparado conforme descrito foi diluído segundo cada uma das metodologias. Para tanto, retirou-se 1 mL do inóculo inicial e colocou-se em tubos de ensaio contendo 9 mL (diluição 1:10) de meio RPMI-1640 em pH 7,0 e pH 5,0 com 2% de glicose( EUCAST). A concentração final correspondeu a 1x105-5x105

ufc/mL. Para CLSI, o inóculo foi 100 (cem) vezes mais diluído, realizando uma diluição 1:50 em RPMI com 0,2% glicose do inóculo inicial e, em seguida outra diluição a 1:20 no mesmo meio, de modo a resultar em inóculo de reação em concentração final equivalente a 5x10² a 2,5x10³ ufc/mL.

Para adição do inóculo de reação às placas descongeladas contendo antifúngicos, verteu-se o inóculo em reservatório em V estéril e utilizou-se pipeta multicanal (11 canais). Adicionou-se 100µL do inóculo na

3. MATERIAIS E MÉTODOS

fileira A da placa de microtitulação e assim sucessivamente, cada inóculo em uma das oito fileiras da placa. As fileiras G e H foram reservadas para cepas-padrão, sendo a G para Candida krusei (ATCC 6258) e H para

Candida parapsilosis (ATCC 22019).

Na coluna 1 colocou-se 200µL de meio RPMI-1640 como controle-negativo e branco para leitura em espectrofotômetro. Na coluna 12, colocou-se 100µL de meio RPMI-1640 com 100µL de inóculo como controle-positivo de crescimento. Incubou-se à 35ºC por 24h e após este período, retirou-se as placas da estufa e com o auxilio de agitador orbital de Klime (Phoenix, EEUU), homogeneizou-se as placas por 15 minutos a 150 rpm, a fim de ressuspender o sedimento e obter turbidez uniforme. As placas foram observadas a “olho-nu” para verificação da ausência de bolhas, que em caso positivo foram retiradas, antes da leitura sob espectrofotômetro.

O parâmetro de leitura foi a turbidez de cada orifício das placas para cálculo de MIC (concentração inibitória mínima). A turbidez foi analisada em espectrofotômetro (Multiskan Titertek, Suécia) sob 492 nm de comprimento de onda. Os resultados fornecidos pelo espectrofotômetro foram expressos em densidade ótica (d.o.) e foram registrados em fita impressa. O controle-negativo serviu para avaliação da esterilidade do meio de cultura usado para crescimento das leveduras e foi preparado apenas com o referido meio. Este controle foi utilizado, também, como branco do equipamento de leitura.

O MIC de cada droga frente aos isolados foi determinado pela turbidez, a qual significa crescimento e de modo contrário, inibição. A menor concentração da droga que inibiu 50% (IC50) de crescimento ou mais em relação ao controle-positivo de cada amostra foi definida como MIC da droga para a amostra em questão.

Para o método M27-A2 do CLSI (NCCLS, 2002), usa-se RPMI-1640, com L-glutamina sem bicarbonato contendo 0,2% de glicose. O MIC foi definido a ”olho-nu” com auxílio de espelho invertido para leitura das placas e sob espectrofotômetro após 48 horas e é considerado no orifício contendo a mais baixa concentração de droga que causa inibição proeminente

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crescimento (inhibition concentration, IC50) relativo ao controle-positivo. Na TABELA 1 e FIGURA 2 observamos exemplo de leitura do teste de sensibilidade, sem a presença de trailing.

TABELA 1. Resultados de leitura espectrofotométrica (densidade ótica, d.o.), de teste de sensibilidade por microdiluição a fluconazol sob pH 7 sem a presença de trailing, frente a um isolado de Candida tropicalis.

Concentração CC 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 CE

densidade

ótica 0,926 0,471 0,171 0,020 0,012 0,011 0,009 0,008 0,007 0,005 0,003 0,000

FIGURA 2. Exemplo de leitura espectrofotométrica (densidade ótica, d.o.), de teste de sensibilidade por microdiluição a fluconazol sob pH 7 sem a presença de trailing, frente a um isolado de Candida tropicalis.

IC: porcentagem de inibição de crescimento em relação ao controle-positivo; CC: controle de crescimento; CE: controle de esterilidade.

Para a interpretação de resultados de amostras não inibidas em >IC50 foram levantadas duas hipóteses: resistência ou ocorrência de fenômeno trailing, definido como crescimento residual acima do MIC (Revankar et al.,1998). Um exemplo do fenômeno trailing consta na TABELA

3. MATERIAIS E MÉTODOS

2 e FIGURA 3. Todas as amostras com esse perfil foram re-avaliadas sob pH 5.

TABELA 2. Resultados de leitura espectrofotométrica (densidade ótica, d.o.), de teste de sensibilidade por microdiluição a fluconazol sob pH 7 com

trailing, frente a um isolado de Candida tropicalis.

Concentração CC 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 64 CE

densidade

ótica 0,993 0,580 0,548 0,496 0,497 0,494 0,549 0,297 0,227 0,225 0,200 0,000

FIGURA 3. Exemplo de leitura espectrofotométrica (densidade ótica, d.o.) de teste de sensibilidade por microdiluição a fluconazol sob pH 7 com trailing,

frente a um isolado de Candida tropicalis.

IC: porcentagem de inibição de crescimento em relação ao controle-positivo; CC: controle de crescimento; CE: controle de esterilidade.

A inibição >IC50 definiu o MIC e os valores de MIC obtidos sob pH 5 e pH 7. Para análise dos resultados de sensibilidade foram compilados os valores de MIC obtidos em ambos os pHs. O impacto do trailing, segundo pH, foi avaliado em relação à determinação do MIC.

O critério interpretativo (breakpoint) para resultados com fluconazol seguiu os limites propostos pelo Doc. Dis. E 7.1 (Cuenca-Estrela et al.,

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2002). Para itraconazol e voriconazol os limites seguidos foram descritos nos documentos M27-A2 (NCCLS, 2002) e M27-S2 (CLSI, 2006). (QUADRO 2).

QUADRO 2. Critério interpretativo de sensibilidade de leveduras do gênero

Candida spp a antifúngicos, segundo comitê de referência.

Sensível S-DD/Intermediário Resistente Antifúngico Método (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) EUCAST < 2 4 > 8 Fluconazol CLSI ≤ 8 16-32 ≥ 64 Itraconazol CLSI ≤ 0,125 0,25-0,5 ≥ 1 Voriconazol CLSI ≤ 1 2 ≥ 4

EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing; CLSI: Clinical Laboratories Standard Institute; S-DD: sensibilidade dependente da dose.

O critério interpretativo (breakpoint) para os resultados de MIC obtidos nos testes com fluconazol, seguiu limites recomendados nos documentos M27-A2 (NCCLS, 2002) e M27-S2 (CLSI, 2006), como está descrito no QUADRO 2.

A estratificação final dos dados foi realizada segundo: i) fenômeno

trailing, ii) amostras sensíveis, iii) amostras intermediárias e S-DD e iv) amostras resistentes. Os valores de MIC foram agrupados por: intervalo, moda, média e desvio padrão. Os valores de MIC necessários para inibir 50% e 90% das amostras, denominados, respectivamente, MIC50 e MIC90

foram determinados. Esses parâmetros foram comparados segundo: cada antifúngico, metodologia e breakpoint.

Na comparação entre as duas metodologias EUCAST e CLSI, resultados de MIC foram considerados iguais quando não houve variação maior do que duas diluições (+ 2 diluições), ou ainda não ocorreu mudança entre as categorias de interpretação de suscetibilidade aos antifúngicos avaliados.

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