Procedimentos laboratoriais

4.3.1.1 Sorologia

A SAM foi realizada de acordo com OIE (Organização Mundial de Saúde Animal). Brevemente, os antígenos vivos utilizados (Quadro 2) foram mantidos em meio líquido Ellinghausen- McCullough-Johnson-Harris (EMJH). As cepas de referência foram cultivadas por 5-10 dias a 30 °C em estufa D.B.O. (Eletrolab, São Paulo, SP). As culturas foram examinadas microscopicamente para assegurar que estavam livres de autoaglutinação e/ou contaminação. Para cada reação foram utilizados soros-padrão positivo e negativo, além disso, foi utilizado um controle negativo, empregando-se solução salina tamponada (NaCl 0,9%) às reações. Cada amostra de soro foi inicialmente diluída a 1:50 em solução salina tamponada (100 µl de soro do paciente, adicionados a 4,9 mL de NaCl 0,9%). Após essa etapa, 50 µL dessa solução foram transferidos para microplacas de vinil de fundo plano contendo 96 poços (Costar, Corning, NY, EUA). Logo após, foi acrescentado o mesmo volume de cada antígeno correspondente nos poços, obedecendo à marcação das placas, obtendo-se uma diluição final de 1:100. As microplacas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37 °C por 90 min. Cada amostra foi observada em microscopia de campo escuro e classificada de acordo com os procedimentos descritos abaixo

(LILENBAUM et al., 2008). Apenas laboratoristas experientes participaram da avaliação de sororreatividade. As leituras foram realizadas em microscópico óptico (Zeiss, Standort Göttingen, Vertrieb, Alemanha), com condensador seco de campo escuro, em magnificação máxima de 200 vezes, observando-se a formação ou não de aglutinações. As amostras sorológicas foram inicialmente analisadas na diluição de 1:100 e, aquelas que apresentavam nível de aglutinação igual ou superior a 50%

eram então, novamente diluídas numa razão geométrica de dois (1:200; 1:400 e 1:800), sendo consideradas reativas quando apresentaram título ≥200. O título sorológico foi representado para recíproca da maior diluição que apresentou resultado positivo. Adicionalmente, o último nível de diluição das amostras foi 1:800, logo, amostras que apresentaram reatividade nesta diluição foram classificadas como ≥800. O maior título alcançado foi utilizado para identificar o sorogrupo infectante.

Quadro 2 - Estirpes de leptospiras utilizadas na etapa de sorologia por meio de Soroaglutinação Microscópica (SAM) de cães dos quatro grupos de estudo.

Espécie Serovar Sorogrupo Amostra de referência

L. biflexa Patoc Semaranga Patoc I (ATCC 23582)

L. borgpetersenii Ballum Ballum Mus 127

L. borgpetersenii Castellonis Ballum Castellon 3

L. borgpetersenii Javanica Javanica Veldrat Batavia 46

L. borgpetersenii Mini Mini Sari

L. borgpetersenii Tarassovi Tarassovi Perepelicin

L. borgpetersenii Whitcombi Celledoni Whitcomb

L. interrogans Australis Australis Ballico

L. interrogans Autumnalis Autumnalis Akiyami A

L. interrogans Bataviae Bataviae Van Tienen

L. interrogans Bratislava Australis Jez Bratislava

L. interrogans Canicola Canicola Hond Utrecht IV

L. interrogans Copenhageni Icterohaemorrhagiae M 20

L. interrogans Hardjo Sejroe Hardjoprajitno

L. interrogans Hebdomadis Hebdomadis Hebdomadis

L. interrogans Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae RGA

L. interrogans Pomona Pomona Pomona

L. interrogans Pyrogenes Pyrogenes Salinem

L. interrogans Wolffi Sejroe 3705

L. kirschneri Butembo Autumnalis Butembo

L. kirschneri Cynopteri Cynopteri 3522 C

L. kirschneri Grippotyphosa Grippotyphosa Moskva V

L. noguchii Panama Panama CZ 214 K

L. santarosai Guaricurus Sejroe Bov. G

L. santarosai Shermani Shermani 1342 K

4.3.1.2 Proteínas recombinantes

As proteínas utilizadas neste experimento foram utilizadas em estudos prévios com soros humanos. Os genes que codificam para fragmentos das proteínas Ligs de

diferentes serovares e espécies foram clonados em vetores de expressão e expressas em Escherichia coli. As proteínas foram purificadas e quantificadas no Laboratório de Tecnologia Recombinante de BioManguinhos (FIOCRUZ/RJ). As proteínas selecionadas para esse estudo foram: LigB7-11(582-947aa) e LigBrep (1-649aa) de L. interrogans serovar Copenhageni e L. kirschneri serovar Grippotyphosa RM52, LigB7-11 (582-947aa) de L. interrogans serovar Pomona, LigBrep (131-649aa) de L. interrogans serovar Canicola, LigANI ( 625-1224aa ) de L. interogans serovar Copenhageni e LipL32 (1- 272aa) de L. interrogans serovar Copenhageni.

Figura 3 – Demonstração esquemática da composição de proteínas LigA e LigB.

Regiões idênticas entre LigA e LigB podem ser observadas, assim como as regiões não-idênticas.

4.3.1.2.1 Quantificação de proteínas

As proteínas utilizadas foram quantificadas pelo método de BCA, associados à análise de eletroforese em gel SDS-PAGE 12,5%. As proteínas, estocadas a -70ºC, foram descongeladas para quantificação e, posteriormente, centrifugadas a 4ºC por 10 min, à rotação de 10.000 rpm (Eppendorf 5417 R, Hamburg, Alemanha) para avaliar possível precipitação.

O método do ácido bicinconínico (BCA) é um ensaio colorimétrico, realizado em microplacas e se baseia na redução de Cu⁺² a Cu⁺¹ na presença de proteínas em meio alcalino (SMITH et al., 1985). Essa reação forma um complexo arroxeado, cuja absorbância é diretamente proporcional à concentração da proteína. Para 128 KDa

201 KDa

realização, foram adicionadas à microplaca diluições-padrão de BSA 10 mg/mL (1,0;

0,8; 0,4; 0,2 e 0,1 mg/mL) e as proteínas de análise diluídas; todas as diluições eram feitas em tampão PBS 1x com Triton-X 100 (Sigma-Aldrich) 0,005%. A seguir, prepava-se a diluição de BCA com solução de cobre (kit BCA Thermo Scientific Pierce) na proporção de 1 parte do reagente B (solução de cobre) para 50 partes do reagente A (solução de ácido bicinconínico). À microplaca, foram adicionados 25 µL das diluições proteicas e 200 µL da solução 1:50. As reações foram incubadas a 37ºC por 30 min, ao abrigo da luz. Todas as diluições foram realizadas em triplicata.

A leitura foi feita por um leitor de ensaios baseados em absorbância (RChisto Sunrise, Tecan, Männedorf, Suíça). A concentração das proteínas foi determinada por comparação com curva-padrão gerada para BSA. Somente foram validadas as quantificações cujo gráfico gerasse índice R²≥0,99.

A análise eletroforética em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5%

(LAEMMLI, 1970) foi realizada para confirmar a quantificação do método já descrito ou sanar discrepâncias de valores gerados pelo método para um mesmo analito.

Além disso, permite avaliar degradação proteica. As proteínas foram acrescidas de tampão de amostra 2x (proporção 1:1) e submetidas à temperatura de 100 ºC por cinco minutos. A seguir o volume de 20 µL de cada amostra foi aplicado no gel de poliacrilamida e submetido à eletroforese por 60 min a 120 V (Mini-Protean III Cell Bio-Rad). O padrão de peso molecular utilizado foi BenchMark Protein Ladder (Invitrogen, 10747-012). Para a visualização das bandas, os géis foram corados por Comassie brilliant blue G-250 (Bio-Rad). Para estimar a concentração da proteína recombinante foram aplicadas diferentes quantidades de BSA (1,0; 0,8; 0,4; 0,2; 0,1 mg/mL). O gel, após corado, foi visualisado e documentado no sistema de fotodocumentação (LTB - 21x26 HE, Loccus Biotecnologia, São Paulo)

Todas as proteínas quantificadas foram padronizadas a 1,0 mg/mL para realização da impregnação em fitas.

4.3.1.2.2 Preparo do lisado de Escherichia coli

Todas as proteínas utilizadas neste estudo foram proteínas recombinantes, originadas de expressão em Escherichia coli BL21 DE3 Star (Invitrogen). Para

diminuir a inespecificidade das reações antigeno – anticorpo, preparou-se um lisado de E. coli para absorção dos anticorpos anti-E.coli . Para isso, foram inoculados 30 µL de cepa de Escherichia coli One Shot Top 10 (Invitrogen) em dez mL de meio Luria-Bertani esterilizado. O preparo foi incubado em estufa por toda a noite a 37 ºC, em rotação de 200 rpm (Innova 44, New Brunswick Scientific, N.J., EUA). Após, foi realizada a centrifugação do inóculo a 4000 rpm por 20 min (Eppendorf Centrifuge 5810 R, Hamburg, Alemanha), descartando o sobrenadante e ressuspendendo o pellet com um ml de PBS 1x Tween 20 0,05% (Sigma-Aldrich). Foi realizada sonicação do material com quatro pulsos de 30 segundos intermeados por intervalos de mesmo tempo (MisonixSonicator XL-2000, Newtown, C.T., EUA). O lisado foi quantificado pelo método de BCA e acondicionado a -70º C até seu uso.

4.3.1.2.3 “Multi-antigen print immunoassay” - MAPIA

A técnica foi realizada como descrita previamente (LYASHCHENKO et al., 2000). Em resumo, os antígenos foram imobilizados individualmente em membrana de nitrocelulose (Advanced Microadevices 150s CPNH-SS40, MDI) com concentração de 100 ng ptn/tira cada, em ambiente a 30º C e umidade relativa do ar em 50%. Um aparelho semi-automático de microaerolisação (Automatic TLC Sampler 4, CAMAG, Muttenz, Suíça) foi utilizado para gerar bandas paralelas entre si e sem marcação visível. Foram aplicados 4,5 µL de cada proteína, em linha, na extensão total de 180 mm de membrana. Depois da impregnação, procedeu-se a incubação da membrana em estufa a 37º C por 1 hora. A membrana, então, foi cortada em tiras de 0,4 cm de largura, de forma perpendicular às bandas de antígeno. Assim, cada tira continha todas as proteínas impregnadas. Foi adicionada proteína A como banda controle da reação antígeno-anticorpo a 29 ng/ tira. As membranas foram bloqueadas por toda a noite com leite desnatado a 4% diluído em PBS 1x Tween 20 (Sigma-Aldrich) 0,05%.

Após esse período, a solução de bloqueio foi descartada e as tiras foram lavadas em PBS 1x Tween 20 0,05%. Na sequência, as tiras foram incubadas em placas (Bio-Rad Mini-Incubation Trays, Hercules,C.A., EUA) com o anticorpo primário na diluição de 1:400 em PBS 1x Tween 20 0,05% BSA 0,25% [Sigma-

Aldrich]) acrescido de 150ug/ml de proteínas totais de E. coli. Essa etapa de incubação foi realizada à temperatura ambiente, sob agitação, por duas horas. A seguir o anticorpo primário foi descartado e as membranas foram lavadas quatro vezes com PBS 1x Tween 20 0,05% com intervalos de dez min entre as lavagens à temperatura ambiente e sob agitação. O anticorpo secundário (anti-IgM) conjugado à fosfatase alcalina (Dog IgM Antibody Alkaline Phosphatase Conjugated, Bethyl Laboratories, T.X., EUA) foi diluído 1:50.000 em PBS 1x Tween 20 0,05% BSA 0,25% (Sigma- Aldrich) e incubado à temperatura ambiente, sob agitação, por uma hora. Na sequência, três lavagens foram realizadas com PBS 1x Tween 20 0,05%

(Sigma- Aldrich), com intervalos de dez min cada, sob agitação, à temperatura ambiente. Ao final foi realizada uma última lavagem com PBS 1x. A revelação das bandas foi realizada com uso de 500 µL de substrato para fosfatase alcalina, por tira (Western Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase, Promega, W.I., EUA), com incubação por quatro min ao abrigo da luz. A reação foi paralisada com água destilada. As tiras foram analisadas por densitometria (Bio-Rad, GS-800 Calibrated Densitometer, Hercules, C.A., EUA) para quantificação dos resultados em termos de intensidade ótica e posterior análise estatística dos parâmetros encontrados. Todos os dados foram analisados por meio do “software” Quantity One 1-D Analysis, Bio-Rad.