PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS

A seguir estão descritos os procedimentos metodológicos para as análises microbiológicas de E. coli presente em águas superficiais dos dois reservatórios investigados. Neste contexto, foram realizadas coletas de águas superficiais nos afluentes de contribuição e também dentro dos dois reservatórios em estudo, para pesquisa da presença de coliformes totais, termotolerantes e Escherichia coli, bem como, do perfil de resistência de Escherichia coli a antibióticos.

Neste item, são apresentados os locais de coleta de águas (4.1.1), bem como os procedimentos para determinação de coliformes totais e termotolerantes (4.1.1.1), para determinação da multirresistência a antibióticos por meio da técnica de antibiograma (4.1.1.2), bem como o cálculo do Índice de Resistência a Antibióticos (4.1.1.3). A (Figura 10) mostra um fluxograma geral das análises realizadas em laboratório.

Figura 10: Fluxograma geral das análises microbiológicas realizadas com amostras de águas superficiais dos reservatórios Passaúna e Piraquara II.

Tubos Múltiplos

Resultado positivo para coliformes termotolerantes

Isolamento de E. coli

Antibiograma

Identificação e confirmação de E. coli Amostras de água

4.1.1 Locais de Coleta

Foram realizadas 3 coletas de água no reservatório Passaúna em 9 pontos distintos, que incluem coletas em afluentes e dentro do reservatório, nos meses de fevereiro e junho de 2016 e março de 2017. No reservatório Piraquara II, também foram realizadas 3 coletas de água em um total de 7 pontos, também em afluentes e dentro do reservatório, nos meses de junho e agosto de 2016 e março de 2017 (figuras 11 e 12, e tabelas 1 e 2).

Figura 11: Identificação dos pontos de coleta do reservatório Passaúna P1 (25°25'40"S; 49°23'20"W) P1’(25°25'40"S; 49°23'20"W)

P3

(25°26'27"S; 49°22'21"W)

P4 (25°26'34"S; 49°23'13"W) P2

(25°25'46"S; 49°23'30"W)

P5 (25°27'27"S; 49°22'56"W) P6

(25°27'24"S; 49°22'57"W)

P7

(25°28'02"S;49°23'59"W)

P9

(25°31'58"S;49°23'37"W)

P8 (25°30’51”S; 49°22’10”W)

Figura 12: Identificação dos pontos de coleta do reservatório Piraquara II

P1

(25°30'22"S; 49°01'42.4"W)

P2

(25°30'52"S; 49°02'18.8"W) P3

(25°30'55"S; 49°03'42.3"W) P4

(25°30'05.4"S; 49°04'54.6"W) P6

(25°29'25.3"S; 49°05'07.8"W)

P5 (25°28'45"S; 49°04'38.5"W)

P7 (25°29'12.3"S; 49°05'29.3"W)

A localização dos pontos de coleta das águas do Passaúna e Piraquara II está apresentada nas tabelas 1 e 2 junto com as coordenadas geográficas.

TABELA 1 - Localização e descrição dos pontos de coleta estudados no reservatório Passaúna

Pontos de Coleta Coordenada (margem direita), na ponte da BR- 277

Ponto localizado no rio Passaúna uma pequena criação de gado de corte

Ponto localizado na ponte Ferraria

Ponto coletado de barco a jusante da ponte Ferraria

Ponto localizado no rio Ferraria, pertencente à bacia do Passaúna, sem habitações por perto e com a presença de mata ciliar

Ponto localizado próximo à captação dentro do reservatório Passaúna, realizada de barco

Ponto localizado na saída do reservatório

TABELA 2 - Localização e descrição dos pontos de coleta estudados no reservatório Piraquara II Pontos de Coleta Coordenada

Geográfica

Ponto localizado na saída do reservatório de Piraquara I e entrada do reservatório de Piraquara II

Afluente localizado próximo a uma propriedade com presença de bovinos e equinos próximos às margens do rio e com influência de processos erosivos

Afluente localizado próximo a uma propriedade de criação de animais

Ponto localizado no reservatório Piraquara II em frente a um Haras

Afluente localizado no bairro de Laranjeiras

Ponto localizado no reservatório Piraquara II com influência da contribuição do bairro laranjeiras

Saída do reservatório Piraquara II (local de pesca)

4.1.1.1 Coleta de amostras e análises microbiológicas

Foram coletadas amostras de água com volume de 1 litro para cada ponto de coleta, em frascos de vidro limpos e autoclavados. As amostras foram transportadas até o laboratório de análises microbiológicas em caixas térmicas com gelo num período máximo de 24 horas (SILVA et al., 2005).

Técnica dos tubos múltiplos

A técnica dos tubos múltiplos é um método utilizado para detecção e/ou contagem de coliformes totais e termotolerantes em água. Essa metodologia permite a quantificação por Número Mais Provável (NMP) de micro-organismos alvos na amostra. Esse número, baseado no cálculo de probabilidade estatística, é uma estimativa da densidade média de micro-organismos na amostra (APHA, 2005; SILVA et al., 2010).

Para o preparo das diluições, foi utilizado o teste de diluição múltipla, no qual ocorrem cinco diluições (10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 e 10^-5) com cinco tubos por diluição.

Para tanto, essa técnica foi dividida em duas fases consecutivas, uma presuntiva e outra confirmativa, conforme esquematizado na figura 9. Na fase presuntiva, foi feita a determinação de micro-organismos fermentadores de lactose (coliformes) utilizando o caldo lauril sulfato triptose (LST) e posterior incubação a 35 +/- 0,5 °C, na qual a presença de coliformes é evidenciada pela formação de gás nos tubos de Durham e, na etapa confirmativa (somente realizada se houvesse crescimento na etapa presuntiva), foi feita a diferenciação de coliformes totais e termotolerantes utilizando-se, como meios, caldo Bile Verde Brilhante 2% (VB) e posterior incubação a 35 +/- 0,5 °C para detecção e quantificação de coliformes totais e caldo Escherichia coli (EC) e posterior incubação a 45,5 +/- 0,2 °C para detecção e quantificação de coliformes termotolerantes. A ocorrência de gás nos tubos de Durham no caldo VB e EC confirma a presença de coliformes totais e coliformes termotolerantes, respectivamente (APHA, 2005; SILVA et al., 2010).

Os resultados foram expressos em NMP/ 100 mL de amostra, a partir da combinação formada pelo número de tubos positivos dos meios descritos anteriormente nas diluições S/D, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4 e 10^-5 identificada em tabelas padrão do método (APHA, 2005). Os resultados de coliformes termotolerantes foram comparados aos limites da resolução CONAMA 357/2005 para águas doces e analisados de forma integrada aos valores de índice pluviométrico acumulado dos 20 dias antecedentes à coleta.

Para identificação de E. coli, foram selecionados os tubos positivos do caldo EC, e cada tubo positivo foi estriado por esgotamento em placas de ágar eosina azul de metileno (EMB) para posterior incubação a 35 +/- 1 °C. Desenvolvimento de colônias típicas nucleadas com centro preto, com brilho verde metálico é sugestivo de E .coli.

A partir da identificação de E. coli em ágar EMB, os isolados foram semeados em ágar Mac Conkey para confirmação de E.coli e em ágar nutriente para isolamento de E. coli e posterior realização do antibiograma. Um fluxograma dos procedimentos metodológicos para identificação de E. coli nas amostras encontram se na figura 13.

Figura 13: Fluxograma desde a coleta da amostra, técnica de tubos múltiplos à identificação de E. coli.

4.1.1.2 Antibiograma

Amostra em frasco estéril

Armazenamento e Transporte

Análise em Tubos Múltiplos

Teste presuntivo

Resultado (+): Teste confirmativo

Resultado (-):

descartar tubos

Resultado (+):

Coliformes totais

Repicar

Resultado (+): Coliformes termotolerantes

Agar EMB

Colônias grandes, pretas azuladas com

reflexo verde metalizada Contagem: NMP/ 100 mL

mL100mL

Caldo EC para confirmação de Coliformes Termotolerantes ttTerTermotolerantestermotoler

antes Caldo VB para confirmação de

Coliformes Totais

Caldo LaurilSulfato

Também conhecido por Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (NCCLS, 2003), o antibiograma é uma técnica destinada à determinação da sensibilidade bacteriana in vitro frente a diversos antibióticos.

O procedimento consiste no preparo de uma suspensão de bactérias por meio da seleção de colônias adequadas do ágar nutriente (2 a 3 colônias em um tubo com 4,5 ml de salina) até obter uma turvação correspondente a 0,5 da escala McFarland.

Semeia-se essa suspensão com auxílio de um swab estéril em uma placa de ágar Mueller- Hinton de maneira suave em todas as direções da placa (em um total de 5 direções) procurando abranger toda a superfície. Deixar a placa secar por 5 minutos para posterior adição dos discos de papel impregnados com antibióticos (Laborclin) com ação para bactérias gram-negativas (Tabela 3). As placas foram colocadas em estufa a 36°C com tempo de incubação de 24 horas, e o padrão de crescimento ou inibição ao redor de cada disco foi avaliado, medindo-se o diâmetro do halo de inibição. Os valores encontrados foram comparados a referenciais do Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI) para determinação da resistência (Figura 14).

Tabela 3 – Antibióticos utilizados para avaliação do antibiograma das cepas de E. coli.

Nitrofurantoína 300 µg NIT

Tetraciclina 30 µg TET

Figura 14: Procedimento para realização do antibiograma (MADIGAN et al., 2010).

4.1.1.3 Determinação do Índice de Resistência a Antibióticos (IRA)

A determinação do IRA foi realizada segundo procedimento descrito por Webster (2004). Valores encontrados nesse índice demonstram a presença de resistência simples ou múltipla resistência a antibióticos. O IRA tem como objetivo fornecer informações sobre a influência antrópica na área estudada. Para a identificação do IRA de cada amostra, foi realizada uma relação entre o número de antibióticos a que a amostra se mostrou resistente pelo número total de antibióticos testados, conforme demonstrado na equação 1 (determinação do IRA por amostra).

Quanto menor o valor resultante, menor resistência a antibióticos a amostra possui.

Turvação correspondente a 0,5 escala de McFarland

Para identificação do IRA por ponto de amostragem, denominado IRA total, foi realizada uma relação entre o número de testes resistentes obtidos em um determinado ponto pelo número total de testes realizados nesse mesmo ponto, conforme demonstrado na equação 2. Quanto menor o valor resultante, menor a resistência a antibióticos que ocorre nesse ponto.

...Eq.1

... Eq. 2

A partir dos índices de resistência, em comparação com dados da literatura, foram discutidos os riscos à saúde humana, decorrentes da presença dos micro-organismos resistentes nas áreas de estudo, e possíveis medidas de gestão ambiental para as áreas.

IRA total = __N° de testes resistentes em um ponto_____

N° total de testes realizado nesse mesmo ponto

IRA por amostra = N° de antibióticos que a amostra é resistente N° total de antibióticos testados