Processamento microbiológico

Cultura

Os frascos contendo VMGA foram agitados no interior da cabine de fluxo laminar por 1 minuto, para facilitar a dispersão dos microrganismos. À seguir, foram

realizadas diluições seriadas (10-1_{, 10} -2_{, 10} -3_{, 10} -4_{), utilizando Fastidious Anaerobe}

Broth (FAB-LabM, Bury, UK).

Cinquenta μL da amostra “mãe” (sem diluição) e 50 μL de cada diluição foram inoculados em placas pré-reduzidas, contendo Fastidious Anaerobe Agar (FAA-LabM, Bury, UK), acrescido de 5% de sangue de carneiro desfibrinado, suplementados por hemina (5 mg/L), e vitamina K1 (1 mg/L). Essas placas foram incubadas à 37°C, em atmosfera de 10% de H2, 10% de CO2, 80% de N2 por até 14 dias, para permitir a detecção de microrganismos anaeróbios estritos. Após a

incubação, as placas “mãe”, 10 -2_{, 10} -4 _{foram examinadas em lupa estereoscópica}

Figura 2: Processamento das amostras pelo método de cultura, para contagem das Unidades Formadoras de Colônias. A - Placa pré-reduzida contendo FAA; B – Cabine

de anaerobiose; C – Placa contendo microrganismos após 7 dias de incubação.

Técnicas moleculares

Extração de DNA

Os tubos contendo VMGAIII com cones de papel absorventes (coletas clínicas) foram descongelados e colocados no agitador de tubos (MA 162- MARCONI, São-Paulo, SP, Brasil). À seguir, o DNA das amostras foi extraído com o kit QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Chatsworth, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante. Após extração, a presença de DNA e sua concentração, em cada amostra, foi verificada por meio de um espectrofotômetro para ácidos nucléicos (NanoDrop 2000, Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA). Após esse procedimento, as amostras foram armazenadas a -80 ºC até seu uso posterior.

Nested-PCR

1. Reação de PCR universal

O volume de DNA das reações foi ajustado de acordo com sua concentração, para que cada reação fosse realizada com aproximadamente 50ng de DNA. Água MiliQ estéril foi adicionada para complementar o volume de 37 μL, que somado à 13 μL do mix de reagentes da PCR, resultava em um volume total de reação de 50 μL. Para cada reação, o mix de reagentes era composto de 5μL de Buffer 10X PCR; 1,5μL de Cloreto de Magnésio; 4μL de dNTP; 1 μL Primer Univ F (25 pMol); 1 μL Primer Univ R (25 pMol); 0,5μL de Platinum Taq DNA Polymerase.

A

Os ciclos de variação de temperatura foram programados em um aparelho termociclador convencional (MJ96G, Biocycler, termocicladores, Curitiba, SC, Brasil), conforme os seguintes parâmetros:

Desnaturação inicial: 94ºC por 4 min. 30 ciclos:

 Desnaturação: 94ºC por 45 seg;

 Anelamento: 60ºC por 45 seg;

 Extensão: 72ºC por 1,5 min;

Extensão final: 72ºC por 15 min.

A mistura de reagentes foi submetida à desnaturação inicial em 94°C por 4 min, seguido de 30 ciclos de desnaturação por 45s à 94°C, anelamento por 45s à 60°C, seguido de uma extensão final em 72°C por 1,5 min.

Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese horizontal em gel de agarose 1% (0,9 g de agarose ultrapura Invitrogen + 900 mL de TAE 1x), corado com 0,5μL de brometo de etídio (10mg/ml), por aproximadamente 45 minutos a 90V e sob temperatura ambiente, em um tampão TAE 1X. Para o controle positivo da reação foi utilizado o DNA extraído de uma cepa bacteriana padrão (ATCC). Ao controle negativo, que tem como objetivo evidenciar qualquer contaminação na mistura de reagentes, não foi acrescentado DNA bacteriano. Produtos de aproximadamente 1500bp, visualizados sob luz ultravioleta, foram considerados positivos.

Tabela 1: Primers utilizados na reação de PCR universal

Primer Sequência Fragmento Referência

Univ. Foward 5’ AG AGT TTG ATY MTG GCT CAG 3’

1,505 bp Willis et al., 1999 Univ. Reverse 5’ ACG GCT ACC TTG

TTA CGA CTT 3’

2. Reação espécie-específica

Verificado o sucesso da reação universal, uma alíquota do produto desta reação foi utilizado como substrato para a realização de outra reação subseqüente de PCR, agora utilizando primers espécie-específicos.

Espécie Sequência Ciclos Fragmento Referência

P.nigrescens F: 5’ ATG AAA CAA AGG

TTT TCC GGT AAG 3’ R: 5’ CCC ACG TCT CTG TGG GCT GCG A 3’ Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 58°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

804 bp Bogen & Slots, 1999

P. tannerae F: 5’ CTT AGC TTG CTA

AGT ATG CCG 3’

R: 5’ CAG CTG ACT TAT ACT CCC G 3’

Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 55°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

550 bp Xia et al., 2000

T. forsythia F: 5´ TGC TTC AGT GTC

AGT TAT ACC T 3´

R: 5´ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3´ Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 56°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

641 bp Slots et al., 1995

Edwards et al., 1989

T. denticola F: 5’ TAA TAC CGT ATG

TGC TCA TTT ACA T 3’

R: 5’TCA AAG AAG CAT TCC CTC TTC TTC TTA 3’

Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 58°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

316 bp Ashimoto et al., 1996

T.socranskii F: 5’ GAT CAC TGT ATA

CGG AAG GTA GAC A 3’

Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s,

288 bp Siqueira et al., 2003

Tabela 2: Reações e “primers” espécie – específicos

R: 5’ TAC ACT TAT TCC TCG GAC AG 3’

56°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

P. gingivalis F: 5’ CAA TAC TCG TAT GCC CGT TAT TC 3’ R: 5’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3’ Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 58°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

478 bp Conrads et al.,1996 Edwards et al., 1989 P. intermedia F: 5’ TTT GTT GGG GAG TAA AGC GGG 3’ R: 5’ TCA ACA TCT CTG TAT CCT GCG T 3’ Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 58°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

575 bp Slots et al., 1995 A.actinomycet emcomitans F: 5’ AAA CCC ATC TCT GAG TTC TTC TTC 3’

R: 5’ ATG CCA ACT TGA CGT TAA AT 3’

Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 50°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

593 bp Ashimoto et al., 1996 F. alocis F: 5’ CGT GGG TAA TCT GCC TTT GTC 3’ R: 5’ CCT TGG TGG GCT TTT ATC TCA 3’ Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 60°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

594 bp Siqueira & Rôças, 1997

F. nucleatum F: 5’ ATT GTG GCT AAA

AAT TAT AGT T 3’

Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s,

1000 bp Ávila-Campos et al.,1999

R: 5’ ACC CTC ACT TTG AGG ATT ATA G 3’

55°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

G. morbillorum F: 5’ AGA GAC GGT ACC

TAA CCA GAA 3’

R: 5’ TAT GAG GTT GGC TGA CTC TCG 3’ Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 52°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

781 bp “Primer” desenhado pela autora a partir do seqüenciamen to genético L14327 do Gen bank

P. micra F: 5’AGA GTT TGA ATC

CTG GCT CAG 3’

R: 5 ’ATA TCA TGC GAT TCT GTG GTC TC 3’

Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 60°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

207 bp Conrads et al., 1997 P. endodontalis F: 5’ GCT GCA GCT CAA CTG TAG TC 3’ R: 5’ CCG CTT CAT GTC ACC ATG TC 3’ Desnaturação inicial 95°C por 2 min e 36 ciclos: 94°C por 30s, 58°C por 1min, 72°C por 2min e extensão final 72°C por 10 min

672 bp Siqueira et al., 2001

Quantificação de Endotoxinas

Para quantificação de endotoxinas foi utilizado o método turbidimétrico Pyrogent -5000® (Lonza, Walkersville, MD, EUA) de Limulus Amebocyte Lysate (LAL). Por meio deste, um ensaio cinético quantitativo foi realizado, no qual a amostra foi colocada em contato com o reagente LAL reconstituído, em seguida incubada em um leitor de microplacas e monitorada automaticamente, através de um software, até o surgimento de turvação. O tempo necessário, antes da ocorrência da turvação (Tempo de reação), é inversamente proporcional à quantidade de endotoxina presente na amostra.

O kit Pyrogent-5000® apresenta: 1. Pyrogent-5000® LAL Reagente;

2. Endotoxina de Escherichia coli 055:B5; 3. Tampão de reconstituição Pyrogent-5000.

Além dos substratos provenientes do kit, também foram utilizados: 1. Água Reagente LAL (Lonza, Walkersiville, MD, EUA);

2. Hidróxido de sódio 0.1 N ou Ácido clorídrico 0.1 N, dissolvidos em água reagente LAL, para ajuste do pH da amostra;

3. Tubos de vidro descartáveis para diluição, isentos de endotoxina; 4. Ponteiras estéreis descartáveis de 10 μL, 200 μL e 1000 μL;

5. Microplacas estéreis descartáveis (Corning Costar, Cambridge, MA, UK);

6. Multipipetador de 8 canais;

7. Reservatórios de reagentes (Lonza, Walkersiville, MD); 8. Leitor de microplacas (Ultramark, Bio-Rad Laboratories); 9. Software WinKQCL® (Lonza, Walkersiville, MD);

10. Cronômetro e agitador vortex.

Padronização da Curva Padrão

O estabelecimento da curva padrão, com concentrações conhecidas de endotoxinas, é necessário para determinar a concentração de endotoxinas com quantidades desconhecidas. A curva-padrão é necessária para determinar a menor

e a maior concentração de endotoxina presente na amostra, assim como os picos obtidos dentro da curva. Como um parâmetro para o cálculo da quantidade de endotoxinas, a curva padrão foi obtida à partir da reconstituição do liofilizado de endotoxina oferecida pelo kit, numa concentração conhecida de 100EU/mL, onde suas diluições alcançam as concentrações finais de: 0,01, 0,1, 1, 10, 100 EU/mL, de acordo com as instruções do fabricante.

Diluições seriadas para obtenção das concentrações de endotoxina da curva-padrão

1. Foi adicionado 0,1 ml de 100 EU/ml endotoxina estoque em 0,9 ml de água para reagente LAL, resultando numa concentração de 10 EU/ml de endotoxinas. Essa solução foi vigorosamente agitada em vortex, por pelo menos 1 minuto antes do procedimento;

2. Foi transferido 0,1 ml da solução de endotoxina 10 EU/ml em 0,9 ml de água para reagente LAL para um recipiente adequado, resultando numa concentração de 1 EU/ml. A solução foi vigorosamente agitada em Vortex, por pelo menos 1 minuto antes do início do procedimento;

3. Foi transferido 0,1 ml da solução de endotoxina 1 EU/ml em 0,9 ml de água para reagente LAL para um recipiente adequado, resultando numa concentração de 0,10 EU/ml. Essa solução foi vigorosamente agitada em Vortex, por pelo menos 1 minuto antes do procedimento;

4. Foi transferido 0,1 ml da solução de endotoxina 0,10 EU/ml em 0,9 ml de água para reagente LAL para um recipiente adequado, resultando numa concentração de 0,01 EU/ml. Essa solução foi vigorosamente agitada em Vortex, por pelo menos 1 minuto antes do início do procedimento.

Padronização das diluições das amostras

Os frascos de vidro, contendo as amostras oriundas do canal radicular e bolsa periodontal, foram colocados em banho-maria (37°C) por 30min. As amostras foram reconstituídas em 1 mL de água de LAL e em seguida extraídas sob agitação mecânica em vortex, por 60 segundos. O teste LAL pode ser influenciado por muitos fatores. Fatores da inibição da detecção de endotoxinas devem ser evitados, para isso foi realizada a adição de uma quantidade conhecida de endotoxina (0,1 EU/ml),

em cada amostra, procedimento que é denominado “Spike”. Em seguida, os testes foram realizados em triplicata, sendo da mesma amostra: 3 poços contendo 100 μL da amostra mãe ou suas diluições; e 3 poços contendo 100 μL amostra + 0.1 EU/mL de endotoxina (Spike). O teste foi realizado como descrito à seguir. Para evitar que houvesse qualquer tipo de interferência (inibição ou desenvolvimento) da amostra com o reagente de LAL, a concentração de endotoxina recuperada dos poços contaminados, calculada pelo software, permaneceu entre 50% - 200%, valor este denominado controle positivo do produto (PPC).

Plate Layout

Para quantificação das endotoxinas presentes nas amostras foram utilizadas placas de cultura de células (96 poços – 12 colunas e 8 fileiras) (Corning Costar, Cambridge, MA) apirogênicas. Inicialmente, 100 μL do “blank” (água de LAL) foram inoculados em triplicata na placa. Em seguida, 100 μL de cada ponto da curva padrão, nas diferentes concentrações (100 EU/mL, 10 EU/mL, 1 EU/mL, 0,10 EU/mL e 0,01 EU/mL), foram distribuídos em triplicata. Após, 100 μL das amostras e seus respectivos controles (PPC) - ambos em triplicata - foram inoculados com reagente de LAL. Para cada poço do controle positivo foi adicionado 10 μL de 0,1 EU/mL de endotoxina de E. coli (spike). A placa foi posicionada no leitor de ELISA (Ultramark, Bio-Rad Laboratories), com Software WinKQCL®, programado para - 340 nm, 37 º C e 100 leituras - 100 μL do reagente de LAL foram adicionados em todos os poços. A leitura das placas teve uma duração de aproximadamente 60 minutos.

Cálculo da concentração de endotoxinas

De forma contínua durante todo o ensaio, o leitor de microplacas/ software Kinetic-QCL foi monitorado na absorbância de 340nm de cada orifício da microplaca. Usando a leitura de absorbância inicial de cada orifício como seu próprio branco, o leitor determinou o tempo necessário para que a absorbância aumentasse a 0.03 unidades. Este tempo foi denominado Tempo de Reação. O software WinKQCL executou automaticamente uma correlação linear log/log do Tempo de Reação de cada padrão com a concentração de endotoxinas correspondente.