O processamento dos órgãos foi iniciado imediatamente após a coleta dos mesmos, primeiramente, fixando-os em solução tampão contendo paraformaldeído (Synth) a 4%. Vinte e quatro horas após a fixação do tecido seccionado, a solução de fixação foi descartada e adicionou-se etanol 70% para início da desidratação tecidual. Novamente, após permanecer 24h em etanol a 70%, o tecido foi imerso por 30 minutos em concentrações crescentes de etanol (80%, 95%, 100%, 100%). Após a desidratação tecidual, realizou-se a diafanização, por meio de imersão em Xilol P.A. (Synth) durante 20 minutos; este processo foi repetido 3 vezes. Finalmente foi realizada a imersão em parafina durante 30 minutos para posterior inclusão e formação dos blocos sólidos.
Uma vez prontos, o tecido cerebral foi seccionado obtendo-se cortes com 5 µm de espessura. Os cortes foram dispostos em lâminas de vidro para coloração tecidual com hematoxilina-eosina.
A coloração com hematoxilina-eosina foi realizada seguindo o protocolo descrito: as lâminas contendo os cortes foram submetidas a 15 minutos de desparafinização em estufa a 60ºC para remoção do excesso de parafina presente no interior do tecido. Após esse processo inicial, as lâminas foram submersas em uma bateria de xilol PA para remoção da parafina residual ainda presente nos tecidos (um ciclo de imersão em xilol por 10 min e outros dois ciclos por 5 minutos). Sequencialmente, foram imersas em diversas concentrações decrescentes de álcool etílico (100%, 95%, 80%, 70%) para realização do processo de hidratação do tecido. Então as lâminas foram imersas em água durante 5 minutos e posteriormente em hematoxilina (2 minutos). Logo após, foram lavadas novamente durante 5 minutos em água corrente para nova imersão no corante basofílico eosina (30 segundos e 2 minutos). As lâminas foram imersas em agua corrente durante 1 minuto e sequencialmente em uma nova bateria de álcool (70%, 80%, 95%, 100%) para
desidratação tecidual e novamente em xilol P.A. Ao final das baterias de imersão, adicionaram-se lamínulas de vidro para montagem final da lâmina.
A análise da histopatologia do cérebro dos animais dos grupos experimentais foi realizada por meio de visualização microscópica em lentes de aumento de 40x e 100x (AX10, Zeiss). Foram observados 20 campos microscópicos/amostra para caracterização do tecido (presença de pontos hemorrágicos, vasos obstruídos por hemácias ou leucócitos, dentre outros).
4.8 Extração de citocinas do cérebro.
Para dosagem de citocinas IL-10, TNF-α e IFN-γ no cérebro dos animais imunizados, parte do órgão coletado previamente durante a eutanásia foi mantido em soro fetal bovino e criopreservado a -80°C.
Para a extração de citocinas, o tecido foi macerado juntamente a solução de extração composta por: 0,4 M de NaCl, 0,05% de Tween-20, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila, 0,1 mM de cloreto de benzetônio, 10 mM de EDTA, 0,02% de aprotinina. Para cada 100 mg de tecido utilizou-se 1 mL de solução de extração para maceração.
Após macerado, o conteúdo foi disposto em microtubos cônicos para centrifugação a 2000 g por 10 minutos, a 4 °C. Então, o sobrenadante foi coletado e armazenado a -80 °C até o momento do uso.
4.9 ELISA de citocinas
A dosagem in loco das citocinas foi realizada de acordo com recomendações do fabricante do kit de ELISA utilizado (Becton e Dickson - BD). Placas de 96 poços foram sensibilizadas com anticorpo de captura nas seguintes proporções: para dosagem de IL-10, TNF-α e IFN-γ utilizou-se diluição de 1:250 de anticorpo de captura. Os anticorpos de captura para IL-10 e TNF-α foram diluídos em tampão fosfato de sódio 0,2 M (0,087 M de Na2HPO4, 0,12 M de NaH2PO4, qsp 1 L, pH 6,5) enquanto os anticorpos de captura para IFN-γ foram diluídos em tampão
carbonato de sódio 0,1 M (0,084 M de NaHCO3, 0,018 M de Na2CO3, qsp 1 L, pH 9,5). A placa, após sensibilização, foi incubada a 4°C por no mínimo 16 horas. A seguir, foram realizadas três lavagens dos poços com PBS-Tween 0,05% e o bloqueio de sítios inespecíficos foi realizado adicionando-se a cada poço 200 µl de solução diluente (PBS 1x acrescido de soro fetal bovino). Seguiu-se, então incubação a 4 oC por 16 horas.
A diluição da curva padrão utilizada para determinação da concentração das citocinas presentes no homogenato foi realizada de forma seriada, partindo-se de 4000 pg/mL até o ponto mínimo de 31,25 pg/mL. Assim como o padrão, as amostras foram adicionadas a cada poço (50 µL/poço), seguindo-se incubação a 4°C por 16 horas. Após este período, as placas foram novamente lavadas e adicionando 50 µL de solução diluente contendo anticorpo de detecção na seguinte proporção: IL-10 1:250, TNF-α 1:500, IFN-γ 1:250. As placas foram incubadas a temperatura ambiente durante 1 hora. A seguir, as placas foram lavadas com PBS- Tween 0,05% e posteriormente foi adicionado a cada poço 50 µL de enzima avidina- peroxidase diluída em solução diluente e incubadas por 30 minutos. As placas foram novamente lavadas (7 vezes as placas de TNF-α e IL-10 e 10 vezes as placas de IFN-γ, respectivamente) com PBS-Tween 0,05% e adicionou-se 50 µL de substrato (TMB) por 15 minutos a temperatura ambiente. A reação da enzima com o substrato foi interrompida utilizando 50 µL/poço de ácido sulfúrico a 2 N. A densidade ótica foi determinada em espectrofotômetro a 450 nm. A concentração de citocinas presentes em cada amostra foi determinada a partir da equação de regressão linear, obtida pelos valores das absorbâncias referentes à curva padrão de cada citocina. A partir desta curva padrão, foi delineado um gráfico de pontos os quais foi possível traçar uma reta de regressão linear com sua respectiva equação. Os valores a e b da equação foram utilizados para o cálculo da concentração de citocinas presentes em cada amostra, juntamente com o valor de suas respectivas absorbâncias. Assim, o valor b apresentado na equação de regressão linear foi subtraído do valor da absorbância da amostra, e posteriormente, o valor obtido foi divido pelo valor encontrado em a.
4.10 Determinação do índice esplênico
Para determinar a atividade do baço dos animais imunizados foi utilizado o índice esplênico. Este consiste na razão do peso do baço (em gramas) do animal pelo seu peso corporal (em gramas) como descrito por Lopes e colaboradores (2015).
4.11 Marcação fenotípica de linfócitos presentes no baço dos animais eutanasiados
Após a eutanásia dos animais, os baços foram coletados e armazenados em 5 mL de meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com 5% de soro fetal bovino (Gibco). Os órgãos foram mantidos a 4ºC até o momento do seu processamento.
Para obtenção dos esplenócitos, cada baço foi macerado em peneiras de malhas com poros de 70 µm (Falcon, BD), utilizando-se 8 mL de meio RPMI1640. A suspensão celular foi, então, centrifugada a 300 g, por 5 minutos, a 4ºC. O sobrenadante foi desprezado e as hemácias presentes no sedimento celular foram lisadas com solução ACK 1x (0,15 M de cloreto de amônio, 0,01 M de bicarbonato de potássio, 0,012 mM de EDTA, qsp. 1L) por 5 minutos, a 37ºC. O tampão ACK foi neutralizado com a adição de meio RPMI suplementado com 5% de soro fetal bovino e a solução foi, então, centrifugada a 300 g, por 5 minutos, a 4ºC.
As células viáveis foram contadas em câmara de Neubauer com o auxílio do Azul de Tripan (Sigma) (diluição 1:100) e ajustadas para a concentração de 106 células (200µL/poço). Estas foram distribuídas em placas com fundo U, centrifugadas para remoção do meio e incubadas com 25 µL do coquetel de anticorpos por 45 minutos, a 4ºC para marcação. Foram utilizados 2 coquetéis compostos pelos anticorpos: anti-CD19 (PercP, Biolegend), anti-CD3 (PercP, Biolegend), anti-CD4 (FITC, Biolegend), anti-CD8 (PE, Biolegend). O primeiro painel, composto por anticorpo anti-CD19, corresponde a marcação das células B no baço dos animais (CD19+), já o segundo painel, compostos por anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 correspondem aos linfócitos T auxiliares (T CD3+ CD4+) e aos linfócitos T citotóxicos (T CD3+ CD8+)
Após marcação, as células foram ressuspensas em 175 µL de meio RPMI suplementado com 5% de soro fetal bovino e centrifugadas a 300 g, a 4ºC por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos, centrifugadas e ressuspensas em tampão de citometria (PBS 1x, 5% de soro fetal bovino (Gibco) e 0,1% de azida de sódio (Vetec)). A leitura das amostras foi realizada no dia seguinte ao processamento, no citômetro de fluxo FACSCanto IITM e as análises por meio do
software FlowJo versão 10. As estratégias de análise utilizadas são demonstradas na figura 7.
Figura 7: Estratégia de análise utilizada para fenotipagem das células marcadas com anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8. As células T foram
selecionadas a partir das células CD3+ e, em seguida, foram identificadas as
populações de linfócitos T CD4+ e CD8+. Da mesma forma foi realizada a
seleção das células B, CD19+, que determina a porcentagem de células B no
4.12 Determinação dos níveis de anticorpo sorológicos em animais imunizados por meio da técnica de ELISA
Os níveis de IgG total foram dosados por meio da técnica de ELISA seguindo-se padronização prévia. Para tal, as placas foram recobertas com 1 µg/poço do antígeno total extraídos de P. berghei ANKA ou NK65, preparado como descrito anteriormente (item 4.2). Para a sensibilização das placas, os antígenos foram diluídos em tampão carbonato (0,018 M de Na2CO3, 0,034 M de NaHCO3, 0,002 M de NaN3, H2O qsp 1 L) e distribuídos a 50µL∕poço, seguindo-se incubação das placas a 4 °C, por no mínimo 16 horas. As placas foram, então, lavadas com tampão fosfato contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween 0,05%) seguindo-se adição de 150 µL/poço de solução bloqueadora (5% de caseína derivada de leite (Molico, Nestlé) diluída em PBS-Tween 0,05%). As placas foram, então, incubadas por 2h a 37°C sendo novamente lavadas quatro vezes com PBS-Tween 0,05%.
As amostras de soro foram adicionadas às placas (50 µL/poço) depois de serem diluídas (1:100) em PBS-Tween 0,05% contendo 5% de caseína. As amostras foram incubadas por 1 hora e 30 minutos à temperatura ambiente sendo a seguir lavadas 4x com PBS-Tween 0,05%. Então, o anticorpo monoclonal anti-IgG conjugado à enzima peroxidase (KLP) foi adicionado a cada poço (volume de 50 µL) na diluição 1:2500. Após incubação por 1 hora a 37°C as placas receberam a adição de substrato (TMB, Beckton Dickinson) sendo incubadas a temperatura ambiente por 10 minutos. A reação foi, então, interrompida com ácido sulfúrico (1:20) (30 µL/poço) e a densidade ótica mensurada a partir de um espectrofotômetro ao comprimento de onda de 450 nm.
Para determinar o índice de reatividade (IR) a média da absorbância obtida das duplicatas foi dividida pelo valor de cutoff (valor obtido somando-se a média das absorbâncias provenientes do soro de 6 animais sadios com 3 desvios padrões (DP)).
4.13 Testes estatísticos
Para análise estatística dos dados obtidos durante o desenvolvimento do presente trabalho foi realizado o teste de normalidade Shapiro-Wilk (n<30 amostras) e quando a distribuição dos dados apresentou normalidade foi utilizado posteriormente o teste de análise de variância por One Way-ANOVA, com pós-teste para comparação múltipla de Tukey. Quando as análises não apresentaram distribuição Normal, foi utilizado o teste de Mann-Whitney ou teste t-Student. Para todos os testes foi estabelecido nível de significância de 5% (*p<0,05). As análises foram realizadas por meio do software GraphPad Prism versão 5.0 para Windows (GraphPad Inc., EUA).
5 RESULTADOS
5.1 Análise da eficácia da vacinação com extrato bruto de PbN contra o desenvolvimento de malária cerebral em animais C57BL/6 desafiados com PbA
Para investigarmos a eficácia da imunização com extrato proteico de P. berghei NK65 ou P. berghei ANKA contra o desenvolvimento de malária cerebral em modelo murino, os animais imunizados foram desafiados com P. berghei ANKA e, então, acompanhados diariamente para a determinação das suas condições físico/clínica (Figura 8) e da curva de mortalidade (Figura 9).
Como esperado, animais pertencentes aos grupos controle (somente desafiados com PbA ou previamente imunizados com CPG-ODN), demonstraram alterações clínicas progressivas a partir do 6º dia da infecção com PbA evoluindo para óbito entre o 7º e o 10º dia (Figura 8 A e B e Figura 9). Todos os animais pertencentes a esses grupos morreram de malária cerebral (escore clínico ≤ 5) como demonstrado pela técnica de Azul de Evans (Figura 11 E e F). Essa técnica possibilita a visualização macroscópica do rompimento da barreira hematoencefálica.
Por outro lado, animais imunizados com extrato proteico de PbN associado ao adjuvante CPG-ODN, bem como aqueles imunizados com PbA associado ao mesmo adjuvante, apresentaram padrão variado de alteração clínica ao longo do tempo de avaliação (Figura 8 C e D). Em ambos os grupos, os animais que demonstram sinais de acometimento neurológico, vieram a óbito entre o 6º e o 7º dia após desafio experimental, apresentando escore clínico ≤ 5. Interessantemente, 46% (6/13) dos animais imunizados com PbN e desafiados com PbA e 69% (9/13) dos quais foram imunizados com PbA e desafiados com parasito homólogo mostraram-se protegidos contra danos neurológicos (Figura 8 C e D). Esses animais (n=15) foram então eutanasiados a partir do 12º dia para avaliação de parâmetros histopatológicos e imunológicos (Figura 9). No momento da eutanásia, 73,3% dos animais eutanasiados apresentavam escore clínico ≥ 8 (Figura 8 C e D). A figura 8 E ilustra os dados compilados de avaliação clinica obtido para cada grupo experimental.
Figura 8: Avaliação clínica dos animais após desafio experimental. A: Grupo de animais apenas desafiados. (n=13) B: grupo imunizado com adjuvante e desafiado com PbA (n=12). C: grupo imunizado com CpG-ODN associado a extrato proteico de PbN e desafiado com PbA (n=13). D: grupo imunizado com CPG-ODN associado a antígeno de PbA e desafiado com PbA (n=13). E: gráfico composto por todos os grupos experimentais. O desenvolvimento do quadro de malária cerebral ocorreu entre o período do dia 6 ao dia 10º dia pós-infecção com P. berghei ANKA.
Figura 9: Taxa de sobrevivência dos animais após desafio experimental. PbA: grupo apenas desafiado com Plasmodium berghei ANKA (n=13). CpG-ODN: grupo imunizado duas vezes com adjuvante e desafiado com PbA (n=12). CPG- ODN PbN: grupo imunizado duas vezes com extrato proteico de Plasmodium
berghei NK65 associado ao adjuvante CPG-ODN e desafiado com PbA (n=13).
CPG-ODN PbA: grupo imunizado duas vezes com extrato proteico de PbA associado ao adjuvante CPG-ODN e desafiado com PbA (n=13). Em vermelho está representado o período para desenvolvimento de malária cerebral em camundongos C57BL/6 em infecções por PbA.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 20 40 60 80 100 CpG-ODN CpG-ODN PbN CpG-ODN PbA PbA Dias pós-infecção S o b re v iv ê n c ia ( % )
5.2 Determinação dos níveis de parasitos circulantes em animais imunizados com antígeno proteico de PbN e desafiados experimentalmente com PbA
O desenvolvimento da parasitemia foi avaliado diariamente para verificarmos se a estratégia de imunização com antígeno proteico de P. berghei NK65 seria capaz de controlar o desenvolvimento da infecção por P. berghei ANKA, espécie causadora de malária grave em camundongos C57BL/6. Para tal, os níveis de parasitemia foram determinados por citometria de fluxo, sendo 20% das amostras também avaliadas por meio da análise microscópica de esfregaços sanguíneos corados com Giemsa. A variação de apenas 1-2% nos níveis de parasitos verificados por ambas as técnicas nos permitiu validar a citometria de fluxo para uso em nossos experimentos.
Os dados de parasitemia obtidos diariamente para os grupos avaliados encontram-se descritos na Figura 10. Observa-se que para o grupo de animais somente desafiados com PbA e para aqueles previamente imunizados com CPG- ODN, os níveis de parasitos circulantes foi inferior a 9%, sugerindo morte por acometimento neurológico como evidenciado pela análise físico/clínica dos animais. Por outro lado, 46% e 69% dos animais imunizados com extrato proteico de PbN e PbA associado ao CPG-ODN, respectivamente, os quais não desenvolveram malária cerebral, apresentaram parasitemia crescente a partir do 9º dia após infecção atingindo picos médios de 31% (n=4) e 38% (n=7), respectivamente, no 15º dia após desafio experimental. Essas parasitemias definiram, junto com a análise clínica dos animais, o estabelecimento de um quadro de hiperparasitemia.
Para certificarmos de que os animais que evoluem para óbito por malária cerebral apresentam carga parasitária inferior àqueles que evoluem para óbito por hiperparasitemia, a parasitemias médias foram comparadas para os grupos imunizados com PbN e PbA. Em relação aos animais imunizados com PbN, aqueles que morreram por hiperparasitemia apresentaram frequência média de parasitos circulantes significativamente superior àqueles que morreram de malária cerebral (parasitemia média: 24 versus 3.3%, respectivamente; Teste de Mann-Whitney; p=0.01). Dados similares foram observados para animais imunizados com PbA
(parasitemia média 27 versus 3.1% para animais que morreram por hiperparasitemia e malária cerebral, respectivamente; Teste de Mann-Whitney; p=0.03).
Figura 10: Níveis de parasitemia apresentados pelos animais após desafio experimental. PbA: grupo apenas desafiado com Plasmodium berghei ANKA. CpG-ODN: grupo imunizado duas vezes com adjuvante e desafiado com PbA. CPG-ODN PbN: grupo imunizado duas vezes com extrato proteico de PbN associado ao adjuvante CPG-ODN e desafiado com PbA. CPG-ODN PbA: grupo imunizado duas vezes com extrato proteico de PbA associado ao adjuvante CPG- ODN e desafiado com PbA. Em vermelho está representado o período para desenvolvimento de malária cerebral em camundongos C57BL/6 em infecções por PbA.
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 CPG-ODN CPG-ODN PbN CPG-ODN PbA PbA Dias pós-infecção P a ra s ite m ia (% )
5.3 Avaliação macroscópica e histopatológica do cérebro de animais imunizados apresentando malária cerebral e hiperparasitemia.
Após eutanásia, os camundongos C57BL/6 foram, em sua maioria, decapitados para verificação da presença ou não áreas de hemorragias no cérebro. Para tal, procedeu-se a retirada da pele/pelo da parte superior da calota craniana. Independente do grupo avaliado, animais que desenvolveram sintomas neurológicos compatíveis de malária cerebral apresentaram nítidas áreas de hemorragia no tecido nervoso (Figura 11 D). Por outro lado, os animais que desenvolveram hiperparasitemia apresentaram aspecto tecidual normal, ou seja, idêntico ao dos animais controle (Figura 11 G e A, respectivamente), corroborando que a hiperparasitemia ocorreu independentemente de acometimentos neurológicos.
Para avaliarmos o comprometimento da barreira hematoencefálica animais apresentando ou não sintomas neurológicos foram inoculados (via i.v.) com o corante azul de Evans, o qual se liga a albumina plasmática. Assim, o rompimento da barreira hematoencefálica pode ser visualizado pelo aspecto azulado de todo o tecido nervoso. Animais que desenvolveram sinais compatíveis de malária cerebral apresentaram intensa concentração de corante no cérebro e, consequentemente, intensa inflamação tecidual (Figura 11 E). Por outro lado, a menor intensidade de corante observado no cérebro de animais hiperparasitêmicos sugere menores danos teciduais (Figura 11 H).
Para confirmarmos a ocorrência de alterações teciduais no cérebro observadas macroscopicamente, o tecido nervoso foi, então, avaliado histopatologicamente. Pela análise microscópica do tecido foi possível observar que, independentemente do grupo avaliado, animais que desenvolveram quadro compatível com malária cerebral apresentaram áreas de hemorragia no parênquima, vasos sanguíneos parcialmente ou completamente obstruídos por leucócitos e hemácias parasitadas/sadias. Em alguns casos, ainda foi possível observar a presença de hemozoína, pigmento derivado do metabolismo dos parasitos, dentro de leucócitos (Figura 12 D). Já em relação aos animais que apresentaram quadro de hiperparasitemia sanguínea, independente do grupo experimental avaliado, a presença de leucócitos aderidos ao endotélio vascular, bem como a presença de vasos obstruídos por hemácias aderidas aos vasos foi nitidamente inferior ao
observado em animais que desenvolveram malária cerebral, novamente sugerindo que nesses animais o nível de inflamação tecidual é inferior a observada em animais com acometimento neurológico (Figura 12 E e F).
Figura 11: Fotografias macroscópicas do cérebro dos animais que desenvolveram quadro de malária cerebral e hiperparasitemia. A, D e G: foto da calota craniana dos animais controle, animais com malária cerebral e hiperparasitemia respectivamente. As fotos B, E e H demonstram a calota craniana após o processo de marcação com azul de Evans dos animais controle, animais com malária cerebral e hiperparasitemia respectivamente. C, J, I: cérebro dos animais controle, com malária cerebral e hiperparasitemia após remoção da calota craniana.
Figura 12: Histopatologia do cérebro de animais controle (A e B), animais que desenvolveram quadro de malária cerebral (C e D) e de animais que desenvolveram hiperparasitemia (E e F). Nas imagens A e B: camundongos controle, vasos desobstruídos. C e D: camundongos com MC, C: região de hemorragia no tecido cerebral com presença de diversas hemácias; D: vaso sanguíneo na região da meninge obstruído por hemácias e leucócitos. E e F: cérebro de camundongos com HP: E: vaso sanguíneo da meninge cerebral com dois leucócitos aderidos e duas hemácias. F: vaso sanguíneo com adesão de leucócito. *: vaso sanguíneo; seta branca: hemácias; cabeça de seta branca: hemácia parasitada por P. berghei ANKA; seta preta: leucócito com hemozoína; cabeça de seta preta: leucócitos. Barra: 10 µm, aumento de 100x.
5.4 Análise dos níveis de citocinas anti-inflamatórias (IL-10) e pró- inflamatórias (TNF- e IFN-) no cérebro dos camundongos segundo padrão clínico apresentado
Considerando que a malária cerebral parece ser um evento mediado pelo balanço entre citocinas anti-inflamatórias e pró-inflamatórias, nós então, investigamos por meio do ELISA, os níveis de IL-10, TNF- e IFN- no cérebro de animais apresentado esse fenótipo clínico em relação àqueles apresentando hiperparasitemia (Figura 13).
Como observado na figura 13, entre as citocinas detectadas no cérebro dos animais que desenvolveram malária cerebral, independente do grupo avaliado, a IL-10 foi aquela que apresentou os maiores níveis teciduais (>1000pg), enquanto TNF-α foi a citocina detectada em menores níveis (< 200 pg). Conforme esperado,