Processos alternativos

O processamento a jusante nunca teria sido desenvolvido como um setor individual da indústria do bioprocessamento sem a cromatografia, cuja simplicidade e seletividade, tornou-a a chave da tecnologia utilizada em todos os processos de bioseparação [8]. Contudo, a cromatografia apresenta-se como o principal centro de custos do processo, maioritariamente devido ao custo das resinas e das colunas e aos tempos dos ciclos

relativamente longos, pelo que têm sido procuradas novas alternativas com custos associados mais reduzidos [2]. Neste sentido, existem duas opções viáveis a serem consideradas: a substituição da cromatografia proA por outros processos cromatográficos, ou a eliminação da cromatografia através da utilização de métodos não-cromatográficos [8]. Baseado nessa estratégia, têm vindo a ser reportados vários métodos alternativos de purificação de IgG, os quais se encontram resumidos e comparados, em termos de rendimentos e purezas, na Tabela 3.

Tabela 3 – Métodos cromatográficos e não-cromatográficos para a purificação de IgG, comparados em termos de rendimento de extração e de pureza.

Método de purificação Ligando Rendimento da IgG (%) Pureza da IgG (%) Referência Métodos Cromatográficos 3 etapas cromatográficas: CTC, CTA, CIH - 85 > 99 [111] CTC Fosfonato 92-98 95 [112]

CTA com membrana de

hidrogel advetivo - > 90 > 85 [113]

CIH com membranas

compostas de PVDF - > 97 > 97 [114] Cromatografia anular contínua ProA 77-82 - [115] Hidroxiapatite 87-92 - [115] Cromatografia de adsorção

em leito expandido ProA 92 98 [116]

Métodos Não-Cromatográficos Eletroforese preparativa - 80 - [117] - 80-90 - [118] Membranas de afinidade Polissulfona - - [119] Celulose regenerada - - [119]

Ião metálico quelante 90 FP = 33,7 [120] Precipitação de afinidade

Eudragit S-100 68 FP = 8 [121]

GAPDH 98 FP = 1,8 [122]

Hapteno peptídico

bivalente > 85 > 97 [123]

Separação Magnética Não- Cromatográfica MagPrepProtein A - - [124] Nanopartículas magnéticas termo- sensíveis 94 > 98 [125] Nanopartículas magnéticas revestidas de amido 69 > 99 [126]

Legenda: CIH – cromatografia de interação hidrofóbica; CTA – cromatografia de troca aniónica; CTC – cromatografia de troca catiónica; FP – fator de purificação; GAPDH – gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; proA – proteína A; PVDF – polivinilidino.

Entre as opções cromatográficas de não-afinidade, a utilização de resinas de troca catiónica para a etapa de captura trata-se de uma alternativa atrativa e promissora dado

que comporta uma matriz cromatográfica uma ordem de magnitude mais barata que a resina de afinidade de proA, permite a remoção de proteínas da célula hospedeira para níveis comparáveis aos do processo tradicional, e pode providenciar capacidades de ligação dinâmica superiores a 100 g/L [11, 12]. Esta alternativa pode ser efetivamente relevante pois a cromatografia proA requer a utilização de um pH acídico durante a eluição, o que pode promover a agregação do produto e a lixiviação de proA da coluna, ao contrário da cromatografia de troca catiónica que não requer um ambiente com baixo pH. Tal como sumariado na Tabela 3, já foi demonstrado o potencial de aplicação de uma plataforma constituída por três etapas cromatográficas para a purificação de IgG, não incluindo a cromatografia proA [111].

Para além disso, têm sido desenvolvidas novas gerações de ligandos, como por exemplo fosfonatos ligados a partículas de Zirconia [112], e destacada a utilização de outras variantes cromatográficas, como a cromatografia de troca catiónica (CTC) [127], a cromatografia de troca aniónica (CTA) [113] e a cromatografia de interação hidrofóbica (CIH) [114]. É, contudo, notório, que a utilização de uma plataforma constituída por 3 etapas cromatográficas (combinando a CTC, CTA e CIH) permite a obtenção de um nível de pureza excecional (> 99%) [111], que não é conseguido por nenhuma das técnicas isoladamente (CTC – 95% [127]; CTA – 85% [113]; CIH – 97% [114]). De um modo geral, e entre as técnicas cromatográficas abordadas, a plataforma de 3 etapas cromatográficas é a estratégia atual mais promissora, pois permite obter elevados rendimentos de extração, com níveis de pureza que permitem atingir os elevados padrões exigidos pela indústria farmacêutica. Por fim, a utilização de cromatografia de afinidade em leito expandido [116] e de cromatografia anular contínua [115] foram também sugeridas como alternativas viáveis para o efeito, embora relativamente a esta última ainda não haja informação referente aos níveis de pureza passíveis de serem obtidos.

Em paralelo, têm vindo a ser desenvolvidas novas tecnologias não-cromatográficas como estratégia alternativas. As principais técnicas utilizadas neste âmbito incluem a eletroforese preparativa [117, 118], filtração por membrana [119, 120], precipitação de afinidade [121-123], separação magnética não-cromatográfica [124-126] e os sistemas aquosos bifásicos [106]. Em geral, a utilização de membranas de afinidade como adsorventes para a purificação de IgG permitem uma boa estabilidade e manutenção dos perfis de adsorção e eluição ao longo de vários ciclos [119]. A eletroforese preparativa aparenta ser também uma alternativa não-cromatográfica promissora, pois para além de permitir extrações aceitáveis de IgG, trata-se de um método que não depende de uma

interação de ligação variável como acontece nas restantes alternativas cromatográficas, permite a sua aplicação a um largo espetro de espécies, apresenta um baixo custo associado e é passível de ser aplicada a uma escala industrial [117, 118]. Por sua vez, recorrendo a partículas magnéticas, é possível separar anticorpos em curtos espaços de tempo, e uma vez que são toleradas partículas em suspensão, não há necessidade de se efetuar nenhuma filtração ou centrifugação anterior ao carregamento da amostra. Finalmente, existe uma tecnologia clássica, bastante estabelecida na indústria farmacêutica, denominada extração líquido-líquido que utiliza solventes orgânicos para o efeito [2]. Contudo, esses solventes orgânicos são na maioria das vezes muito voláteis e tóxicos, e as proteínas, em particular, apresentam baixa solubilidade e elevada propensão para desnaturação na presença destes [128]. Deste modo, a sua utilização em processos biotecnológicos limita-se apenas à recuperação de produtos de baixo peso molecular, tais como antibióticos e ácidos orgânicos de meios de fermentação [129]. Neste sentido, como uma técnica alternativa de extração líquido-líquido, surgem os sistemas aquosos bifásicos (SAB), que têm vindo a demonstrar um enorme potencial e versatilidade para o processamento a jusante de biofármacos, como os anticorpos monoclonais, lipoproteínas de elevada densidade, hormonas, citocinas, fatores de crescimento e ADN plasmídico, tal como revisto por Rosa et al. [2].

De todas as técnicas alternativas abordadas neste capítulo, as técnicas não-

cromatográficas apresentam-se mais promissoras relativamente às técnicas

cromatográficas, uma vez que, de uma forma geral, permitem atingir elevados rendimentos de extração e elevados níveis de pureza, aliados à simplicidade, robustez dos métodos e menor custo energético e/ou económico. De um modo geral, e apesar de nem todos os métodos permitirem atingir os exigentes critérios que a indústria farmacêutica impõe, alguns apresentam um potencial promissor para cumprir esses critérios. Em particular, a plataforma constituída por três etapas cromatográficas [111] permite atingir um elevado grau de pureza (> 99%) de IgG, que é efetivamente o mínimo exigido pela indústria farmacêutica; contudo, a separação magnética constitui um método não- cromatográfico que permite atingir o mesmo nível de pureza dessa plataforma através da utilização de nanopartículas e com apenas uma etapa de extração [126]. Deste modo, a separação magnética revela estar entre as técnicas mais eficientes abordadas, visto que permite bons rendimentos e um nível de pureza adequado para a sua eventual utilização em humanos, para além de que a separação é feita em alguns minutos e sem que sejam necessários pré-tratamentos da amostra, revelando-se assim como uma técnica vantajosa

relativamente à cromatografia proA. No entanto, os SAB são uma alternativa não- cromatográfica ainda mais relevante e com elevado potencial para a purificação de IgG, e serão discutidos mais pormenorizadamente no capítulo 1.7 desta dissertação.