Atualmente existem inúmeras alternativas na remoção de com- postos nitrogenados tanto biológicas como físico-químicas. Sabe-se que os processos biológicos normalmente são de baixo custo e demandam menos mão de obra do que os demais.
Quanto aos processos biotecnológicos de remoção de nitrogênio cita-se: a nitrificação - desnitrificação conhecido como processo con- vencional, do qual os primeiros estudos datam de 1890 (KHIN e AN- NACHHATRE, 2004); processo SHARON, uma das alternativas da nitrificação propostas mais recentemente; processo ANAMMOX, oxi- dação anaeróbia da amônia; e processo CANON, remoção completa de amônia via nitrito.
3.4.1 Nitrificação/desnitrificação: Processo convencional
O processo de nitrificação/desnitrificação convencional consiste da nitrificação autotrófica da amônia a nitrato, ou seja, oxidação do N (- III) a N (V) e desnitrificação heterotrófica do nitrato a nitrogênio gaso- so, redução do N (V) a N (0). Essas reações ocorrem dentro das células ou bactérias, por isso são consideradas reações bioquímicas (GER- RARDI, 2002).
3.4.1.1 Nitrificação
Espécies pertencentes ao gênero Nitrosomonas e Nitrobacter são responsáveis pela maior parte da nitrificação na natureza (ANTHONI- SEN et al, 1976).
As bactérias do gênero Nitrosomonas oxidam amônia-N (-III) a nitrito-N (III) com hidroxilamina como um produto intermediário, en- quanto as bactérias do gênero Nitrobacter oxidam N-NO2- (III) a N-
NO3- (V) em uma única etapa (GRADY et al., 1999).
A reação de nitrificação aeróbia da amônia envolve o oxigênio gasoso como aceptor final de elétrons, e ocorre segundo as Equações 3 e 4.
0 2 2 2 4 2 2 3 G H O H NO O NH + + Nitrosomonas→ − + + + +∆ Equação 3 0 3 2 2 2 1 G NO O NO − + Nitrobacter→ − +∆ Equação 4
O crescimento das bactérias do gênero Nitrosomonas é mais fa- vorecido do que o das Nitrobacter, tal afirmação se comprova assumin- do que o crescimento celular é proporcional à energia liberada na reação e pelo fato de que a reação de oxidação da amônia ser 3,0-3,8 vezes mais energética (240 a 350 KJ.mol-1) do que a oxidação do nitrito (65 a 90 KJ.mol-1) (WIESMANN et al., 2007).
Segundo Henze et al. (1997) a equação que determina a reação da oxidação da amônia a nitrato, como sendo uma única etapa, é apresenta- da na Equação 5 O H 04 , 1 CO H 88 , 1 0,98NO NO H 0,020C 1,98HCO 1,86O NH4++ 2+ 3-→ 5 7 2+ 3-+ 2 3+ 2 Equação 5 Nas diferentes etapas da oxidação da N-NH3 (-III) a N-NO3- (V),
as reações são catalisadas por enzimas específicas. As reações mais complexas ocorrem na primeira etapa a nitritação ou oxidação da N- NH3 (-III) a N-NO3- (III) onde aparecem intermediários como NH2OH
(hidroxilamina). Duas enzimas que participam dessas reações são as mais importantes, a amônia monooxigenase que age na conversão de NH3 para NH2OH e hidroxilamina oxidoredutase que age na conversão
de NH2OH para HNO2. Existem outras enzimas catalisando reações na
região da parede celular das bactérias oxidadoras de amônia, conforme representado na Figura 3, como a nitrito redutase que age na redução do HNO2 a NO e a óxido nítrico redutase que catalisa a redução do NO a
N2O e por fim a óxido nitroso redutase que catalisa a reação de redução
do N2O a N2 (HOOPER et al., 1997; KLOTZ e STEIN 2007; BOCK e
Figura 3 – Componentes do sistema de oxidação de nitrogênio e trans- porte de elétrons em Nitrosomonas. AMO – amônia monooxigenase; HAO – hidroxilamina oxidoredutase; P460 – citocromo P460; Q – ube-
quinona-8; CycB – tetrahemo citocromo c da membrana; c552 – cito- cromo c552; ccp – dihemo c553 peroxidase; NiR – nitrito redutase; NOR óxido nítrico redutase; N2OR – óxido nitroso redutase. As linhas
sólidas representam mecanismos conhecidos e as linhas pontilhadas representam mecanismos não completamente conhecidos, portanto,
hipotéticos.
Fonte: HOOPER et al., 1997.
Em uma segunda etapa, apresentada na Figura 4, ocorre a oxida- ção do nitrito-N (III) a nitrato-N (V), ou seja, nitratação. Nesta etapa participam as bactérias do gênero Nitrobacter. A reação é catalisada pela enzima nitrito oxidoredutase (NXR), essa enzima se encontra liga- da na parte interna da parede celular da célula. Essa enzima age tanto na oxidação do nitrito a nitrato como na redução do nitrato a nitrito, portan- to a reação é reversível. Outra enzima de papel importante nessa reação é a HCO (hemo-cobre oxidase) do citocromo a3, grupo de proteínas,
contendo um átomo de cobre no grupo hemo, que fazem parte do siste- ma transportador de elétrons das mitocôndrias e agem como coenzimas intermediárias da cadeia respiratória celular (HOOPER, et al. 1997; KLOTZ e STEIN 2007; GARCÍA-HORSMAN et al., 1994).
Figura 4 – Componentes do sistema da reação de nitratação e suas en- zimas correspondentes. NXR – nitrito oxidoredutase; c550 – citocromo c550; HCO – hemo-cobre oxidase; PMF – força motriz de prótons; ATP
– adenosina tri-fosfato; ADP – adenosina di-fosfato. Fonte: Adaptado de KLOTZ e STEIN 2007.
De fato sabe-se que as bactérias nitrificantes são autotróficas, portanto elas não têm a capacidade de incorporar compostos orgânicos exógenos, por obterem energia da oxidação de compostos inorgânicos. Muitas das equações que definem a cinética de crescimento das bacté- rias nitrificantes não levam em consideração que o dióxido de carbono é a única fonte de carbono necessária. Ainda a taxa máxima de crescimen- to das nitrificantes é muito menor quando comparado a taxa de cresci- mento das heterotróficas (GRADY et al., 1999).
Apesar de o processo de nitrificação ser autotrófico também pode ocorrer pela ação de bactérias heterotróficas, que utilizam o carbono orgânico e oxidam a amônia a nitrato, como Arlhrobacer e Thiosfera pantotropha (BITON, 2005).
A taxa de crescimento da biomassa nitrificante é pequena e vai depender das condições de crescimento. Vários são os parâmetros que influenciam na performance de nitrificação de populações de bactérias nitrificantes, como oxigênio dissolvido (OD), pH, temperatura (T), tem- po de retenção hidráulico (TRH) e tempo de retenção celular (TRC), destes OD e pH são os mais importantes (WISMANN et al., 2007).
O OD deve ser monitorado em um reator onde se objetiva a nitri- ficação completa principalmente por poder apresentar uma forma de seleção das diferentes populações, isso ocorre facilmente, independendo do objetivo.
Segundo Canziani et al. (2006) as populações de bactérias oxida- doras de nitrito são facilmente inibidas pela limitação do oxigênio dis- solvido, tal acontecimento é facilmente evidenciado na Tabela 5, onde percebe-se que a razão da concentração celular da população de bacté- rias oxidadoras de amônia em relação as bactérias oxidadoras de nitrito (XNS/XNB) aumenta consideravelmente quando é restringido o OD do
meio.
Tabela 5 – Parâmetros calculados e medidos das populações de bacté- rias oxidadoras de amônia e bactérias oxidadoras de nitrito. µNS – velo-
cidade específica de crescimento da população de oxidadoras de amô- nia; µNB - velocidade específica de crescimento da população de oxida-
doras de nitrito; OD – oxigênio dissolvido no meio. Período do experimento
µ
NS (d-1)µ
NB (d-1) XNS/ XNB Observações 233-328 0,625 0,555 2,96 OD > 2,0 mg.L-1 358-369 0,450 0,129 16,54 OD entre 0-0,5 mg.L-1 370-383 0,468 0,192 25,02 384-396 0,474 0,256 42,43 397-405 0,632 0,395 31,66 OD entre 0,5-1,5 mg.L-1 420-433 0,582 0,275 18,97Fonte: Adaptado de Canziani, 2006
O pH tem significativa importância quanto ao crescimento celu- lar, conforme observa-se na Figura 5, na operação de reatores nitrifican- tes principalmente por reger o equilíbrio das formas de amônia (NH3) e
amônio (NH4+), e nitrito (NO2-) e ácido nitroso (HNO2), pois, efetiva-
mente, somente amônia e ácido nítrico são os doadores de elétrons, ou seja, substrato, isso porque a célula gasta menos energia para transportar essas formas pela parede celular do que as formas ionizadas amônio e nitrito (WISMANN et al,.2007)
Figura 5 – Velocidade de crescimento específica das bactérias do gêne- ro Nitrosomonas (µNS) e Nitrobacter (µNB) em função do pH, da Tem-
peratura e Concentração do meio de alimentação. Fonte: WISMANN et al,.2007.
Ainda Anthonisen, et al. (1976) demonstraram que mesmo em pHs próximos da neutralidade, dependendo da concentração de amônia total e nitrito do meio, pode existir inibição de Nitrosomonas e/ou Ni- trobacters pela presença de amônia livre ou ácido nitroso em excesso. A Figura 6 apresenta a inibição de Nitrosomonas e Nitrobacters conforme a variação do pH e da concentração de amônia total e nitrito. Por fim, para que o oxigênio dissolvido não seja limitante à uma nitrificação completa, deve-se manter uma concentração superior a 2 mg O2 L-1 no
Figura 6 – Comportamento das bactérias do gênero Nitrosomonas e
Nitrobacter em diferentes faixas de concentração de amônia livre e áci- do nitroso em função do pH.
Fonte: adaptado de ANTHONISEN et al, 1976. 3.4.1.2 Desnitrificação
A desnitrificação faz parte do ciclo do nitrogênio, é a transforma- ção do NO3 a N2 em condições de ausência de O2. Este é um processo
redutivo e desta maneira é uma forma de respiração. Ocorre em quatro estágios, segundo a Equação 6.
NO3- → NO2- → NO → N2O → N2 Equação 6 Zona de inibição da Nitrobacter e Nitrosomonas Zona de inibição da Nitrobacter Zona de nitrificação completa [N -N O2 - ] m g L -1 [N -N H3 ] m g L -1 Zona de inibição da Nitrobacter
Cada etapa dessa reação é catabolisada por metaloenzimas espe- cíficas, recentemente foram visualizadas as estruturas dessas enzimas em alta resolução, com exceção da óxido nítrico redutase. Além disso, já se sabe que podem ser mais de um tipo de redutase por etapa. Em geral, as enzimas necessárias para a desnitrificação somente são produzidas sob, ou próximo a, condições anaeróbias, e se as células em crescimento anaeróbio forem expostas ao O2 essas enzimas são prontamente inibidas.
Ainda, as reações são catabólicas, ou seja, regidas por microrganismos heterótrofos, necessitando de matéria orgânica, como fonte de carbono para sua síntese celular (SPANNING, et al. 2007; MENDONÇA, 2002; METCALF e EDDY, 2003).
Segundo Tiedje (1988) apud Abreu (1994) os microrganismos mais frequentemente encontrados na natureza são dos gêneros Pseudo- monas e Alcaligenes. Entretanto muitos outros são descritos na literatura como sendo microrganismos que realizam reações de desnitrificação, como, Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter , Bacillus, Brevibacterium, Chromobacterium, Corynebacterium, Flavo- bacterium, Hypomicrobium, Moraxella, Neisseria, Paracoccus, Propio- nibacterium, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Spirilun, e Vibrio entre outros gêneros dessas bactérias (METCALF e EDDY, 2003).
Contudo nas últimas duas décadas muitos estudos foram feitos para comprovar que as reações de oxidação da amônia e redução do nitrato podem ser realizadas por um único microorganismo através da nitrificação heterotrófica, ou seja, a desnitrificação ocorreria em ambien- tes aeróbios (CASTIGNETTI e HOLLOCHER, 1984; ROBERTSON, et al. 1989; PATUREAU, 1994; BAEK, et al., 2001)
Na maioria das bactérias as enzimas responsáveis pela desnitrifi- cação recebem elétrons provenientes das correntes dos sistemas respira- tórios da membrana citoplasmática. Em outras palavras, a desnitrifica- ção é uma forma de respiração e parte componente da respiração com o sistema de transporte de elétrons.
A desnitrificação ocorre com a participação de componentes es- pecíficos. Entre eles o ubequinol/ubequinona. A reação de redução do ubequinona para ubequinol ocorre utilizando elétrons provenientes de redutores como, NADH, ácidos orgânicos voláteis, succinato, etc. Na desnitrificação, o ubequinol é oxidado diretamente na parede citoplas- mática pela nitrato redutase. Há uma estrutura cristalina correspondente para tal enzima, normalmente conhecida como “Nar”, assim sabe-se em
detalhes como a enzima funciona. Em resumo, o ubequinol é oxidado em direção a superfície periplasmática da membrana, com a liberação de H+ para o periplasma, mas a transferência de elétrons ocorre através da
membrana para o sitio ativo, que está localizado em um domínio globu- lar que se projeta para dentro do citoplasma. Mas o ponto fundamental a observar aqui é que a transferência de elétrons por Nar, juntamente com a liberação de H+ e absorção nos dois lados da membrana, gera uma força motriz de prótons através da membrana. A localização do sítio de redução de NO3- no lado citoplasmático da membrana requer um siste-
ma de transporte de NO3- conforme observado na Figura 7. Tal tarefa
acredita-se ser a função da proteína NarK que é um transportador tanto de fora para dentro da célula como o inverso. Normalmente a proteína NarK é a fusão de duas proteínas juntas. Evidências apontam para que uma dessas proteínas catalise a entrada do NO3- para a célula com um ou
mais H+. Isso permitiria a entrada do NO3- na célula para iniciar a respi-
ração.
No estado estacionário, a importação do NO3- seria em troca da
exportação do NO2- para o periplasma, um processo que seria o inter-
câmbio neutro de elétrons e assim não afetando, nem dissipando, a força motriz de prótons.
A exportação do NO2- para o periplasma é necessária em função
de que é onde se localiza a nitrito redutase (NIR em Figura 12) nos sis- temas desnitrificantes (BAKER, et al. 1998; MOIR e WOOD, 2001; SPANNING, et al. 2007; ZUMFT, 1997)
Figura 7 – Esquema do processo de desnitrificação completa em Para-
coccus denitrificans. Linhas tracejadas: transportes dos óxidos de nitro- gênio; linhas sólidas: transporte de elétrons. SDH, succinato dehidroge- nase; NDH, NADH dehidrogenase; Q, quinona; bc1, complexo citocro-
mo bc1; c550, citocromo c; paz, pseudoazurina; NAR, nitrato redutase da
membrana; NIR, nitrito redtase tipo cd1; NOR, óxido nítrico redutase
tipo BC; NOS, óxido nitroso redutase; NarK, transportador NO3-/NO2-.
Fonte: SPANNING, et al. 2007.
Os elétrons são entregues para o citocromo cd1, por um monohe-
mo citocromo tipo c, o citocromo c550, ou pela proteína cupredoxina
conhecida como pseudoazurina. Estas duas proteínas periplasmáticas e hidrosolúveis são redusidas pelo complexo integral da membrana, cha- mado de complexo citocromo bc1, que por sua vez é reduzido a ubequi-
nol. Este complexo não é específico da desnitrificação, ele ocorre em diversos sistemas respiratórios em todas as bactérias e na transferência mitocondrial de elétrons
O óxido nítrico é gerado pela nitrito redutase, mas em baixas concentrações por causa da sua toxicidade, todavia este não deixa de ser um intermediário livre da desnitrificação. A óxido nítrico redutase é uma enzima presente na membrana celular, que participa da redução do óxido nítrico a óxido nitroso. Acredita-se, ainda não comprovado em laboratório, ser fornecida pela pseudoazurina ou pelo citocromo c550 em
comum com a nitrito redutase. A etapa final da desnitrificação é catali- Periplasma
Citoplasma
Equivalentes redutores Succinato
sada pela óxido nitroso redutase, outra enzima periplasmática, age na redução do óxido nitroso à nitrogênio gasoso (BAKER, et al. 1998; MOIR e WOOD, 2001; SPANNING, et al. 2007; ZUMFT, 1997).
Segundo Wrage et al. (2001), os microrganismos responsáveis pela desnitrificação são anaeróbios facultativos, ou seja são capazes de utilizar tanto o oxigênio como o NO3- e NO2-. Portanto, o processo é
inibido inclusive em baixas concentrações de oxigênio dissolvido. Quanto aos intermediários do processo de desnitrificação o NO e N2O são gasosos e se acumulam no meio quando suas enzimas são ini-
bidas principalmente em pH baixo.
Os microrganismos oxidam um substrato orgânico como fonte de energia produzindo inúmeros equivalentes de redução.
A relação C/N (carbono/nitrogênio) influencia na competição en- tre a redução dissimilatória do nitrato à produtos gasosos e a amonifica- ção (ISOLDI & KOETZ, 2004).
Segundo Her et al. (1995) a eficiência de desnitrificação não é comprometida quando a relação C/N está acima de 1 utilizando metanol e acima de 2 utilizando ácido acético como fonte de carbono, conforme observado na Figura 8.
Figura 8 – Efeito da relação C/N na eficiência de desnitrificação. Nitro- gênio: (▲) nitrato; (●) nitrito; e (□), (◊), (∆), (○), são 20, 40, 60, 80% de
[N-NO2-]/[N-NOx-], respectivamente. Usando como fonte de carbono
em “A” metanol e em “B” ácido acético. Fonte: Her et al, 1995.
E fi ci ên ci a de d es ni tr if ic aç ão ( % ) E fi ci ên ci a de d es ni tr if ic aç ão ( % ) B A
3.4.2 Novas alternativas para remoção de nitrogênio
As novas alternativas para remoção de nitrogênio são na sua mai- oria baseadas na eliminação de nitrogênio utilizando o nitrito como aceptor de elétrons e não o nitrato. Para se ter nitrito disponível é neces- sário realizar nitritação (nitrificação parcial), em que a subsequente oxidação do nitrito seja impedida.
Algumas dificuldades quanto ao estabelecimento desses proces- sos são encontradas principalmente em se tratando de longos períodos de operação e a fase estacionária normalmente é difícil de ser atingida. Alguns cuidados devem ser tomados com a maioria desses processos quanto a possível eliminação de nitrito para o meio ambiente, isso por causa da considerável toxicidade do mesmo.
3.6.2.1 Anammox
Durante as últimas duas décadas o processo anammox evoluiu de uma parte bastante inexplorada do ciclo biológico do nitrogênio. Tor- nou-se claro que anammox é uma peça chave no ciclo global do nitro- gênio. O processo anammox é a oxidação da NH4+ para N2 com o NO2-
como aceptor final de elétrons (Equação 7). A energia livre de Gibbs associada a esta reação é ainda maior do que a para a oxidação aeróbia do NH4+ e da suporte ao crescimento autotrófico, como foi referido pela
primeira vez por Engelbert Broda em 1975. O processo anammox real- mente foi descoberto 10 anos mais tarde, em um reator piloto utilizado para desnitrificação no tratamento das águas residuárias provenientes de uma fábrica de levedura. Esta descoberta foi importante por duas razões. A primeira, o processo anammox é muito atrativo para tratamento de efluentes com altas concentrações de nitrogênio amoniacal. Em segundo lugar, que por mais de um século o ciclo global do nitrogênio era consi- derado completo, porém não havia uma forma de a amônia ser oxidada sob condições anóxicas. (OP DEN CAMP et al. 2007).
NH4+ + NO2- → N2 + 2H2O Equação 7
A rota metabólica proposta por JETTEN, et al (1999) indica que o aceptor de elétrons, nitrito, é reduzido a hidroxilamina e a hidroxila- mina reage, de maneira desconhecida ainda, com o doador de elétrons amônio, culminando com a produção de nitrogênio gasoso. No entanto
uma nova rota foi propostas, esquematizada na Figura 9, onde a hidrazi- na é o intermediário desta última etapa, postulando que a oxidação da hidrazina, catalisada pela enzima hidrazina oxidase, a N2 gera os elé-
trons para a redução inicial de nitrito, catalisada pela enzima nitrito redutase, a hidroxilamina. Parte desta rota metabólica ocorre dentro de um compartimento peculiar dessas bactérias chamado Anammoxosoma, que ocupa de 30 a 60% do volume da célula (JETTEN et al.,2000).
Figura 9 – Mecanismo da oxidação anaeróbia da amônia. NR é a enzima nitrito redutase (NH2OH é o produto assumido); HH é a enzima
hidrasina hidrolase; HZO é a hidrazina oxidase, que é equivalente a hidroxilamina oxidoredutase, produzida pelas oxidadoras aeróbia de
amônia.
Fonte: JETTEN et al. 2001.
Os microrganismos do processo anammox são abundantes no meio ambiente. Segundo Reginatto et al. (2005), observaram consumo de nitrito e amônia na fase de enriquecimento da biomassa desnitrifican- te de lodo de uma lagoa de tratamento de efluentes de abatedouro, atra- vés de análise por hibridização in situ de amostras da biomassa confir- maram a existência de microrganismos do filo Planctomycetes compro- vando que as perdas de nitrogênio na fase de enriquecimento da biomas- sa eram causadas por atividade anammox.
Segundo Schierholt Neto (2007) que inoculou dois reatores a- nammox e acompanhou seu enriquecimento, o dejeto de suíno mostrou- se como uma promissora fonte de inóculo para o enriquecimento de
microrganismos oxidadores anaeróbios de amônia. O reator inoculado com lodo proveniente de uma lagoa de nitrificação/desnitrificação desa- tivada se mostrou como um inóculo de melhor qualidade que o retirado do de um decantador secundário de um sistema de lodos ativados tratan- do dejetos de suínos.
3.6.2.2 Remoção autotrófica completa de nitrogênio via nitrito (CANON)
No processo CANON a remoção de amônio ocorre por dois pro- cessos distintos. No primeiro, o amônio é parcialmente convertido a nitrito (nitritação) por microrganismos aeróbios oxidadores de amônio sob condições de oxigênio limitado. Em segundo bactérias anammox convertem o nitrito produzido junto com parte do amônio remanescente a nitrogênio gasoso e pequena quantidade de nitrato. Ambos os proces- sos ocorrem em um único reator, e em um único estágio segundo as Equações 8 e 9 (SLIEKERS et al, 2002).
NH4+ + 1,5O2 → NO2- + 2H2O + H+ Equação 8
NH4+ + 1,32NO2- → 1,02N2 + 0,26 NO3- + 2H2O Equação 9
O desempenho do processo CANON depende da competição en- tre os microrganismos envolvidos. Os microrganismos oxidadores de nitrito devem competir com os oxidadores de amônia (competição por oxigênio) e com os microrganismos anammox (competição pelo nitrito). Os microrganismos autotróficos envolvidos no processo CANON têm diferentes taxas de crescimento em diferentes temperaturas, mudanças de temperatura podem resultar em mudanças no desempenho do proces- so (HAO, et al. 2002).
Neste processo a oxidação do nitrito a nitrato (nitratação) é inibi- da pela baixa concentração de OD e pela elevada concentração de NH4+
no meio (5 mmol L-1 ou 70 mg L-1 de N-NH4+). A eficiência deste tipo
de sistema é ligada diretamente com o fornecimento de oxigênio dissol- vido, conforme o tamanho dos agregados ou espessura do biofilme, maiores quantidades de oxigênio podem ser fornecidas, aumentando a eficiência do sistema (NIELSEN et al, 2005).
Existe um grande número de estudos do processo CANON em escala laboratorial. A carga volumétrica aplicada é mais baixa do que a
aplicada ao ANAMMOX. Contudo, como somente um reator é requeri- do, ha economia significativa que pode ser vantajosa dependendo do efluente a ser tratado (SCHMIDT et al, 2003).
Segundo Nielsen (2005), um reator SBR do tipo air lift, com o processo CANON estabelecido, remove até 1,5 Kg m-3 d-1, além de a biomassa suportar distúrbios na composição do efluente.
3.6.2.3 Sistema de reator único para processo de conversão de altas concentrações de íon amônio em nitrito (SHARON)
O processo SHARON foi concebido para promover a remoção biológica de nitrogênio via nitrito em efluentes com altas concentrações de amônio. É uma excelente alternativa de nitrificação para elevada concentração de amônio e baixa relação C/N. Ele não produz grande quantidade de lodo biológico, requer menos oxigênio que o processo