Atualmente, as microalgas são vistas como matéria-prima alternativa para produção de biodiesel, sendo alvo de um grande número de investimentos de organizações públicas e privadas que objetivam utilizar tecnologias mais eficazes e baratas para produzir grandes quantidades de óleo. Embora o biodiesel de microalgas não seja rentável ainda para competir com o diesel fóssil, investigações estão sendo feitas para transformá-lo em um produto economicamente viável. E a principal rota de investigação é a produção do biodiesel, que consiste na separação e secagem da biomassa, extração do óleo e/ou processo de síntese do biodiesel.
3.5.1 Separação da microalga
Após o cultivo, seja em fotobiorreatores ou em sistemas raceways, a biomassa de microalgas deve ser separada do meio de cultura para que seja aproveitada. O método adequado para a remoção de elevadas quantidades de água e o processamento de grandes volumes de biomassa de microalgas pode envolver uma ou mais etapas, e podem ser utilizados diferentes métodos físicos, químicos e biológicos para executar a separação sólido- líquida desejada, visto que dependendo do processo podem ser introduzidas substâncias que limitam o desencadeamento da obtenção do produto esperado (BRENNAN e OWENDE 2010, MATA et al. 2010). Os métodos de coleta comumente utilizados incluem a sedimentação, centrifugação, filtração, ultra-filtração, às vezes com uma etapa adicional de floculação ou uma combinação de flotação com floculação (WANG et al., 2008). Meios de cultura são geralmente diluídos, com isso, a recuperação da biomassa do meio tem sido responsável por contribuir com 20-30% do total de gastos para a produção de biomassa (MILLEDGE e HEAVEN, 2013; GRIMA et al., 2003).
Nesse sentido, a literatura vem reportando o uso de biofloculantes como etapa intermediária no processo de separação da biomassa, com o propósito de reduzir o dispendioso processo de centrifugação. Teixeira et al., (2012), por exemplo, utilizaram sementes de Moringa Oleifera como agente floculante de Chlorella vulgaris, obtendo 89% de floculação em apenas 120 minutos.
A seleção de espécies que são facilmente colhidas viabiliza o processo de produção do biodiesel e de outros produtos de interesse.
3.5.2 Secagem da biomassa microalgal
A etapa de secagem é extremamente importante, visto que elementos intracelulares tais como óleos são difíceis de serem extraídos da biomassa úmida através do uso de solventes, sem uma ruptura prévia da célula. Sendo este extraído com melhores resultados de biomassa liofilizada (MOLINA et al., 2003).
A biomassa úmida obtida após o processo de separação é perecível e deve ser processado rapidamente após a colheita; desidratação ou secagem são comumente utilizadas para esta finalidade, dependendo do produto final desejado. Vários métodos de secagem da biomassa já foram testados, dentre estes se destacam a secagem ao sol, com spray-drying
(pulverização da amostra em uma câmara submetida a uma corrente de ar quente), tambor de secagem (drum-drying) (transferência de calor para a amostra através das paredes internas do cilindro do tambor), liofilização (congelamento da amostra e remoção da umidade por sublimação), secagem por atomização, por leito fluidizado, dentre outras (CARDOSO et al., 2011).
A secagem ao sol é o método mais barato de desidratação. Mas, apresenta desvantagens quanto ao tempo de secagem, exigência de grandes superfícies para secagem, e o risco de perda de material (PRAKASH et al., 1997). A atomização é comumente usada para a extração de produtos de alto valor, mas é relativamente cara e pode causar uma deterioração significativa em alguns pigmentos (DESMORIEUX e DECAEN, 2006). A liofilização é uma das técnicas mais utilizadas, mas também se constitui como um processo caro, para operações em grande escala. Entretanto, seu processo propicia facilitação na extração de óleos.
3.5.3 Extração do óleo de microalgas
Após a secagem, ou em alguns casos utilizando biomassa úmida, segue-se para a ruptura celular das células de microalgas para a liberação dos metabólitos de interesse. Vários métodos de extração podem ser usados dependendo da parede da microalga e, sobretudo da natureza do produto a ser obtido. A extração pode ocorrer por ação mecânica (homogeneizadores, moinhos, ultrassom, autoclave e pulverização) ou ação não-mecânica (congelamento, solventes orgânicos, choque osmótico, hidrólise ácida, básica e reações enzimáticas), ou ainda a combinação de ambas as técnicas visando uma extração eficiente, além da extração por dióxido de carbono supercrítico (SHOW et al., 2015; APARIA et al., 2015).
Idealmente, uma tecnologia de extração de lipídeos para produção de biodiesel de microalgas tem de exibir um nível elevado de especificidade para triacilglicerídeos, a fim de minimizar a co-extração de não-lipídeos contaminantes, ou outras frações de lipídeos que não são tão facilmente convertidos em biodiesel (RAMLUCKAN et al., 2014; KIM et al., 2013).
A extração usando solventes orgânicos apresenta-se como o método mais utilizado. O solvente selecionado teve ter como base a seletividade e eficiência na quebra entre as ligações dos lipídeos com as outras organelas das células que apresentam tanto interações de van der Waals quanto ligações covalentes e de hidrogênio. Assim, utiliza-se na extração, solventes
orgânicos polares e apolares para assegurar uma extração completa dos lipídeos das microalgas (HALIM et al., 2012).
Métodos gravimétricos baseados na extração com hexano em Soxhlet ou no método de Bligh e Dyer (extração com mistura clororfórmio/metanol) são comumente empregados para extraçãode lipídeos totais. Contudo, estes apresentam diferentes respostas dependendo do tipo de parede celular constituinte da espécie trabalhada. Além destes, existe uma variedade de solventes que foram testados para essa finalidade com resultados satisfatórios (HALIM et al., 2012). Os utilizados comumente são o hexano, clorofórmio, éter de petróleo, metanol, etanol, isopropanol, diclorometano e a mistura destes.
De forma geral, após a extração são obtidos os lipídeos totais, que compreendem ácidos graxos, hidrocarbonetos, esteróides, acilgliceróis, pigmentos e os glico- e fosfolipídeos. Os lipídeos neutros, que são a fração conversível em biodiesel, são obtidos pela redissolução dos lipídeos totais em hexano, seguida da filtração em carvão ativado para remoção de pigmentos (KROHN et al., 2011).
Têm sido realizados estudos com o emprego de extração assistida por ultrassom ou micro-ondas, buscando-se o máximo de remoção dos lipídeos (RANJAN et al., 2010). Santos et al., (2015) compararam diferentes métodos de extração de lipídeos na biomassa de Chlorella vulgaris. Utilizando como solventes: etanol, hexano e misturas de clorofórmio: metanol e distintos mecanismos de ruptura celular, tais como, o uso de homogeneizador Potter e ultrassom. Os mesmos observaram que entre os métodos testados, a mistura clorofórmio: metanol (2:1) assistida por ultrassom foi o mais eficiente, extraindo cerca de 19% do total de lipídeos, das quais 55% eram triglicéridos.
Balasubramanian e colaboradores, (2011) realizaram comparações entre extrações utilizando hexano como solvente extrator, com e sem irradiação de micro-ondas. Segundo os autores, a extração assistida por micro-ondas possibilitou uma maior recuperação de lipídeos, com uma maior proporção de ácidos graxos poliinsaturados. Foram também realizadas comparações entre métodos de rompimento celular, incluindo, além de micro-ondas e ultrassom, a moagem com nitrogênio líquido e lise enzimática. Os resultados apontaram uma melhor eficiência para a moagem com nitrogênio, seguida da lise enzimática. Uma avaliação quanto à viabilidade econômica deve, contudo, ser realizada, principalmente no que diz respeito à obtenção das enzimas (ZHENG et al., 2011).
Um método bastante inovador é a extração por fluido supercrítico, onde o gás carbônico sofre pressão e aquecimento, adquirindo ambas as propriedades de líquido e gás. Este fluído liquefeito atua como solvente, extraindo o óleo da biomassa microalgal. Neste
processo é possível capturar mais energia da célula lipídica, favorecendo a conversão, sendo substancialmente melhor quando comparado ao processo convencional (MORIOKA et al., 2014).Uma restrição ao uso do CO2 supercrítico é que a amostra deve estar completamente seca, pois a umidade pode servir como barreira à difusão do CO2, além do custo operacional para cultivos em larga escala (MERCER e ARMENTA, 2011).
Estimativas mais rápidas para quantificação de lipídeos neutros intracelulares in vivo podem ser obtidas por citometria em fluxo, utilizando o corante vermelho do Nilo (CHEN et al., 2013). Esta técnica baseia-se na medida da fluorescência do corante dissolvido em lipídeos neutros e da fluorescência da clorofila, com picos de emissão em 570 e 675 nm, respectivamente. Por se tratar de um método rápido e menos laborioso, tem sido muito empregado para seleção de espécies de algas de alta produtividade em triacilgliceróis (MONTERO et al., 2011).