Foi analisada a fonte produtora de IL-10 nos pacientes com HTLV-1 em 12 indivíduos, sendo oito (67%) portadores do vírus e quatro (33%) com a forma HAM/TSP. A média de idade diferiu significativamente entre os portadores do vírus e aqueles com HAM/TSP (45 ± 8,6 e 56 ± 3,1 anos, respectivamente; p=0,017). No
A B C * * ** *** ****
Grupo dos indivíduos com HAM/TSP houve uma mais alta prevalência de indivíduos do sexo masculino (75%) em relação aos portadores do vírus (25%), p<0,05.
A frequência de células expressando IL-1 foi avaliada e observou-se uma maior frequência de monócitos expressando IL-10 (20,7 ± 24,9), quando comparados aos Linfócitos TCD4+ (5,4 ± 6,5), TCD8+ (9,5 ± 19,4) e B (6,7 ± 11,8), no total dos indivíduos, p<0.05 (Figura 14A). Analisando os indivíduos portadores (Figura 14B), foi observada, também, uma maior frequência de monócitos expressando IL-10 (21,7 ± 24,7) em relação as TCD4+ (6,3 ± 7,5), TCD8+ (4,9 ± 8,6), p<0.05, entretanto, não foi observada diferença em relação aos linfócitos B (8,1 ± 14,1; p>0.05).
No grupo dos indivíduos com HAM/TSP não foi observada alterações de frequência celular expressando IL-10 (Figura 14C) (monócitos = 19 ± 25,1; CD4+ = 3,6 ± 3; CD8+ = 18,8 ± 29,2; linfócitos B = 4,1 ± 3, p>0.05), apesar de se observar uma tendência para uma maior frequência das células CD8+ e monócitos expressando IL- 10.
Figura 14 - Frequência de células CD4+, CD8+, Monócitos e Linfócitos B expressando IL-10, de indivíduos infectados pelo HTLV- 1, no total dos indivíduos analisados (A), nos portadores do vírus (B) e nos pacientes com HAM/TSP (C).*p=0,019, **p=0,05, ***p=0,036, ****p=0,012.
Ao analisar se os antígenos de Schistosoma spp são capazes de aumentar a frequência de células expressando IL-10 foi observado que, nas células TCD4+ os antígenos rSm29 e rShTSP-2 aumentaram a frequência destas células expressando IL-10 (Figura 15A) (7,3%, p=0.034; 7,5%, p=0.023; respectivamente), em relação as
*
* **
*** ****
células sem estímulo (5,4%), no total dos indivíduos analisados, sendo que a adição do PIII não mostrou diferença (6,5%). No grupo dos indivíduos portadores do vírus, o rSm29 aumentou a frequência das células TCD4+ expressando IL-10 (8,9%; p=0,05) em relação as células não estimuladas (6,3%) (Figura 15B). Já os antígenos rShTSP-2 e PIII não mostraram diferença (8,3%; 7,8%, respectivamente, p>0,05). No grupo da HAM/TSP os três antígenos analisados não alteraram a frequência de TCD4+, expressando IL-10, (Figura 15C) (4,2%; 6%; 4%; respectivamente, p>0,05) em relação às células não estimuladas (3,6%).
Figura 15 - Frequência de células CD4+ expressando IL-10, nos indivíduos infectados pelo HTLV- 1, antes e após a adição dos antígenos de Schistosoma spp.
No total dos indivíduos (A), no grupo dos portadores (B) e naqueles com HAM/TSP (C). *p=0,023, **p= 0,034, ***p=0,05.
Avaliando a adição dos antígenos sobre a frequência das células TCD8+ expressando IL-10 foi observado que o rShTSP-2 e PIII foram eficiente em aumentar essa frequência (Figura 16A) (13,1%, p=0,034; 10,9%, p=0,034, respectivamente), em relação as células não estimuladas (9,5%), no total dos indivíduos analisados. A adição do rSm29 não mostrou diferença em relação as células não estimuladas (13,9, p>0,05). No grupo dos indivíduos portadores (Figura 16B) a adição do PIII
*
*** **
aumentou a frequência das células TCD8+ expressando IL-10 (6,9%, p=0,017), em relação as células não estimuladas (4,9%). O rSm29 e o rShTSP-2 não alteraram a frequência destas células (10,9%; 9,1%; respectivamente, p>0.05). No grupo dos indivíduos com HAM/TSP (Figura 16C) nenhum dos três antígenos aumentou a frequência destas células (rSm29 = 19,9%; rShTSP-2 = 21%; PIII = 18,9%; p>0,05 respectivamente) em relação as células não estimuladas (18,8%).
Figura 16 - Frequência de células CD8+ expressando IL-10, nos indivíduos infectados pelo HTLV- 1, antes e após a adição dos antígenos de Schistosoma
spp, no total dos indivíduos analisados (A), no grupo dos portadores do vírus
(B) e naqueles com HAM/TSP (C). *p=0,034, **p=0,017.
Os antígenos analisados não alteraram a frequência dos linfócitos B expressando IL- 10 (rSm29 = 6%; rShTSP-2 = 10%; PIII = 5%; respectivamente, p>0,05) em relação as células não estimuladas (7%), no total dos indivíduos analisados; (Figura 17A) . O mesmo foi observado no grupo dos indivíduos portadores (Figura 17B) (rSm29 = 5,3%; rShTSP-2 = 10,8%; PIII = 4,9%; respectivamente, p>0,05; sem estímulo = 8,05%) e no grupo com HAM/TSP (Figura 17C) (rSm29 = 7,4%; rShTSP-2 = 7,6%; PIII = 4,3%; respectivamente, p>0,05; sem estímulo = 4,1%).
* *
Figura 17- Frequência de Linfócitos B expressando IL-10, nos indivíduos infectados pelo HTLV- 1. Antes e após a adição dos antígenos do Schistosoma
spp, no total dos indivíduos analisados (A), no grupo dos portadores do vírus
(B) e no grupo com HAM/TSP (C).
A adição do rSm29 aumentou a frequência de monócitos expressando IL-10 (Figura 18A) (20,1%, p=0,05) em relação as células não estimuladas (19,8%), no total dos indivíduos analisados. O rShTSP-2 e o PIII não alterou a frequência destas células (25,2%, 22,2%; respectivamente, p>0,05). No grupo dos indivíduos portadores (Figura 18B) os três antígenos não foram capazes de aumentar essa frequência (25,5%; 24,8%, 25,2%; respectivamente, p>0,05) em relação as células não estimuladas (21,7%). No grupo dos indivíduos com HAM/TSP (Figura 18C) os antígenos não aumentaram a frequência destas células (rSm29 = 30,8%; 30,03%; 20%; respectivamente, p>0,05) em relação as células não estimuladas (18,9%).
Figura 18- Frequência de Monócitos expressando IL-10, nos indivíduos infectados pelo HTLV- 1, antes e após a adição dos antígenos de Schistosoma
spp, no total dos indivíduos (A), nos portadores do vírus (B) e no grupo com
HAM/TSP (C). *p=0,05. *
DISCUSSÃO
Neste estudo nós avaliamos se antígenos do Schistosoma spp são capazes de alterar in vitro a produção de citocinas e o perfil nas células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos infectados pelo HTLV-1.
A forte resposta imune que ocorre na infecção pelo HTLV-1 explica o fato de alguns indivíduos infectados desenvolvem sérias complicações, enquanto aqueles que permanecem assintomáticos durante boa parte de suas vidas e, a produção de citocinas nestes indivíduos é variável. Estudos tem mostrado que indivíduos infectados pelo HTLV-1 têm altos níveis de produção das citocinas IFN-γ e TNF, mesmo sem adição de estímulo In vitro às culturas de CMSP, quando comparadas às culturas de células de doadores de sangue soro negativos para HTLV-1 (Santos, S. B. et al., 2004; Carvalho, E. M. et al., 2001).
Concentrações elevadas de citocinas pró-inflamatórias, ou que induzem a proliferação de linfócitos, a exemplo da IL-2, TNF, IFN-γ, e IL-15, entre outras e, expressão do receptor de IL-2, têm sido relatadas tanto em pacientes com HAM/TSP, quanto em indivíduos assintomáticos (Azimi, M. et al., 1999; Carvalho, E. M. et al., 2001; Nishiura, Y. et al., 1996). Existem, entretanto, evidências de que uma resposta imune exagerada participa da imunopatogênese da HAM/TSP, com a documentação de que em relação aos portadores da infecção, pacientes com HAM/TSP produzem níveis mais elevados de TNF e IFN-γ, além de IL-6 e IL-2 detectadas no soro e no líquor (Nagai, M. et al., 2001; Lima, M. A. et al., 2005; Ohbo, K. et al., 1991; Andrada-Serpa, M. J. et al., 1996; Nishimoto, N. et al., 1990). Eles também apresentam um maior número de células T CD4+ e T CD8+ expressando estas citocinas (Lima, M. A. et al., 2005). Adicionalmente existe uma diminuição da
capacidade regulatória da resposta imune exacerbada, por IL-10 e TGF-β nestes pacientes (Lima, M. A. et al., 2005).
Ainda não existem tratamentos satisfatórios ou uma forma de prevenir o desenvolvimento da doença nos indivíduos infectados pelo HTLV-1 e a resposta imune exacerbada é à base desta patologia (Castro, N. M. et al., 2006). Estratégias capazes de reduzir a resposta imune inflamatória do tipo Th1 se fazem necessárias. Um estudo prévio conduzido pelo Serviço de Imunologia da Universidade Federal da Bahia mostrou que em indivíduos infectados pelo HTLV-1 e coinfectados com S. mansoni os níveis de IFN-y no sobrenadante de culturas de CMSP não estimuladas foram mais baixos do que em indivíduos com HTLV-1 não co-infectados (Porto, A. F. et al., 2005).
Foi também demonstrado previamente, que os antígenos do Schistosoma mansoni, Sm29 e PIII são capazes de induzir a produção de IL-10 pelas CMSP de indivíduos infectados pelo S. mansoni (Cardoso, L. S. et al., 2006; Cardoso, L. S. et al., 2011) e que eles suprimem a resposta inflamatória do tipo Th2 em um modelo experimental de asma alérgica (Cardoso, L. S. et al., 2010).
Os antígenos Sm29, ShTSP-2 e PIII foram testados neste estudo para verificar a capacidade de induzir a produção de IL-10 e suprimir a resposta do tipo Th1 in vitro pelas CMSP de indivíduos infectados pelo HTLV-1.
Nós observamos que a adição do rShTSP-2 nas culturas de células resultou na redução dos níveis de IFN-y e TNF. Os três antígenos utilizados, foram capazes de diminuir a produção destas citocinas em uma significativa proporção de indivíduos avaliados. Além disso, o modulação negativa da produção de IFN-y por Sm29 e ShTSP-2 foi seguida por um aumento da produção de IL-10 na maioria dos indivíduos e, este aumento na produção de IL-10 alcançou mais de 300%. A redução
da produção de IFN-y pelo uso do rSm29 e do PIII nas culturas de CMSP e o aumento dos níveis de IL-10 pelo uso de rSm29 também foi vista em pacientes com Leishmaniose cutânea, uma doença cuja patologia também está associada com uma forte resposta imune do tipo Th1 (Báfica, A. M. B. et al., 2011).
Avaliando possíveis características dos indivíduos associadas com a habilidade destes antígenos em modular negativamente a produção de IFN-y, nós observamos que indivíduos que apresentaram inibição na produção destas citocinas pela presença de rSm29 nas culturas foram aqueles que tiveram menores níveis basais de IFN-y, quando comparados à aqueles que não apresentaram inibição na produção de IFN-y. Inesperadamente, não observamos nenhuma outra diferença clínica, imunológica ou de carga viral entre os grupos de indivíduos que tiveram redução nos níveis de IFN-y e aqueles que não tiveram. Em pacientes com Leishmaniose cutânea (Báfica, A. M. B. et al., 2011), a adição de rSm29 e PIII as culturas de células estimuladas com o antígeno solúvel de Leishmania (SLA) resultou em uma redução da produção de IFN-y e TNF independentemente das concentrações basais desta citocina e da apresentação clínica dos pacientes..
A relação entre a infecção pelo HTLV-1 e S. mansoni não está bem estudada e existem dados controversos. Por exemplo, a frequência de infecção pelo S. mansoni em indivíduos com HTLV-1 de um banco de doadores de sangue é maior que em indivíduos negativos do mesmo banco de sangue. Entretanto, a frequência de indivíduos com HAM/TSP, nesta mesma casuística, foi menor em indivíduos infectados pelo S. mansoni, comparados com aqueles não infectados (Porto, A. F. et al., 2005).
Nós mostramos que os antígenos rSm29 e rShTSP-2 usados neste estudo foram capazes de induzir in vitro a produção de IL-10 e este resultado está de acordo com
outros estudos, mostrando que o antígeno rSm29 induziu maior produção de IL-10 pelas CMSP de indivíduos infectados com S. mansoni do que nos indivíduos não infectados (Cardoso, L. S. et al., 2006).
A IL-10 tem um importante papel na manutenção do estado de portador nos indivíduos infectados pelo HTLV-1, balanceando a produção de IFN-γ, uma importante citocina pro-inflamatória (Britto-Melo, G. E. P. et al., 2007). Recentemente foi descrito uma incapacidade de IL-10 recombinante humana em modular negativamente a produção de IFN-γ in vitro em indivíduos com HAM/TSP (Santos, S. B. et al., 2006). A baixa razão entre IFN-γ/IL-10 por alguns antígenos de Schistosoma spp neste estudo sustenta a hipótese de que estes antígenos podem ser utilizados para prevenir patologias em indivíduos infectados pelo HTLV-1 (Lima, L. M. et al., 2013).
As quimiocinas também participam do processo inflamatório na infecção pelo HTLV- 1. Já foi demonstrado, por exemplo, que a quimiocina CXCL9, juntamente com a CXCL10, reconhecida como importante no recrutamento de células Th1, estavam aumentadas no soro de pacientes com HAM/TSP, quando comparado com os portadores assintomáticos do HTLV-I ou com controles saudáveis. O dado sugere que a presença destas moléculas pode levar a um aumento no recrutamento de moléculas pró-inflamatórias para o tecido medular, contribuindo para o dano associado ao desenvolvimento da HAM/TSP (Guerreiro, J. B. et al., 2006; Shevach, E. M. 2002). Neste estudo observamos que a adição dos antígenos rSm29 e rShTSP-2 as culturas de células resultou em diminuição da produção de CXCL-9 no sobrenadantes das CMSP, em relação as células não estimuladas, nos indivíduos com HTLV-1, tanto no total dos indivíduos analisados, quanto nos portadores e nos indivíduos com HAM/TSP.
Estes resultados mostram que os antígenos de Schistosoma spp usados neste estudo são capazes de modular negativamente a resposta imune exacerbada do tipo Th1 in vitro em uma alta porcentagem de indivíduos infectados pelo HTLV-1. Esta modulação negativa pode ser explicada pelo aumento da produção de IL-10.
Existe ainda a possibilidade de existir outros mecanismos induzidos pelos antígenos de Schistosoma spp que podem estar envolvidas na modulação negativa da resposta imune do tipo Th1 na infecção pelo HTLV-1. Estudos mostram, em um modelo de asma induzida pela ovoalbumina, que antígenos de S. mansoni induzem a expansão da população de células regulatórias T CD4+CD25+Foxp3+ (Pacífico, L. G. et al., 2009; Porto, A. F. et al., 2005).
Em outra etapa deste estudo avaliamos a capacidade dos antígenos de Schistosoma spp em aumentar a frequência das células TCD4+ eTCD8+ com perfil modulatório.
As células TCD4+ participam da manutenção da tolerância imunológica por suprimir a expansão e ativação de linfócitos reativos que podem causar doenças autoimunes (Sakaguchi, S. et al., 2001; Shevach, E. M. 2002). As Células TCD4+ com perfil regulatório incluem aquelas que expressam a molécula CTLA-4 (cytotoxic T limphocyte-associated antigen 4) (Shimizu, J. et al., 2002; McRugh, R. S. et al., 2002; Read, S. et al., 2000; Salomon, B. et al., 2000; Takahashi, T. et al., 2000). As células que expressam esta molécula podem ter um papel modulatório nas doenças inflamatórias, a exemplo da infecção pelo HTLV-1.
O Foxp3 (forkhead transcription factor) também é requerido para o desenvolvimento e função das células T regulatórias (Hori, S. et al., 2003; Khattri, R. et al., 2003; Fontenot, J. D. et al., 2003). O aumento da expressão desta molécula em células com perfil modulatório poderá diminuir a linfoproliferação espontânea de células
TCD4 e manifestações clínicas associadas com doenças autoimunes, caracterizada por infiltrado linfocítico em múltiplos órgãos e grande produção de citocinas proinflamatórias observadas em indivíduos com HAM/TSP (Yamano, Y. et al., 2005). Já se sabe que pacientes com HAM/TSP apresentam características imunológicas semelhantes a camundongos mutantes para Foxp3 e deficientes para CTLA-4, incluindo linfoproliferação espontâneas de células TCD4+ e manifestações clínicas associadas com doenças autoimunes, caracterizada por infiltrado linfocítico em múltiplos órgãos e grande produção de citocinas proinflamatórias (Yamano, Y. et al., 2005).
Os três antígenos analisados aumentaram a população destas células expressando CTLA-4 no total dos indivíduos do estudo, o rSm29 e o rShTSP-2 nos portadores. A expressão da molécula CD25 nas células T podem conferir diferentes propriedades a estas células, dependendo da intensidade da expressão. As células expressando CD25 constituem 1-2% da população de CD4+ periférica. As CD4+CD25Low representam células T ativadas (Beacher-Allan, C. et al., 2001; Viglietta, V. et al., 2004; Lindley, S. et al., 2005). Os antígenos rSm29 e PIII foram eficientes no presente estudo, em aumentar a população destas células expressando CTLA-4, o que dá a elas características modulatórias. Os antígenos utilizados neste estudo também foram capazes de aumentar a população das células CD4+CD25Low expressando Foxp3 no total de indivíduos, nos portadores e, o rShTSP-2 e o PIII aumentaram a frequência destas células nos indivíduos com HAM/TSP.
Todos os antígenos analisados foram capazes de aumentar a frequência das células CD4+CD25high , que são as que classicamente exibem funções regulatórias (Baecher-Allan, C. et al., 2001), em todos os indivíduos analisados, inclusive nos
pacientes com HAM/TSP. Também foram capazes de aumentar a frequência destas células T regulatórias expressando CTLA-4 e Foxp3. Tem sido demonstrado que em pacientes com HAM/TSP expressão menores quantidades de mRNA para Foxp3 e CTLA-4 nas células CD4+CD25+, quando comparado com indivíduos saudáveis (Yamano, Y. et al., 2005). Nossos resultados mostram que os antígenos do Schistosoma spp. podem aumentar a expressão destas moléculas nas células de pacientes com HTLV-1. O fato da menor expressão de Foxp3 em células CD4+CD25+ de pacientes com HAM/TSP sugere que o HTLV-1 possa ter um efeito inibitório na expressão de Foxp3, que a população das CD4+CD25+ possa ser diminuída em pacientes com HAM/TSP, ou alternativamente que pacientes com HAM/TSP possam ter geneticamente baixa expressão do gene Foxp3 (Yamano, Y. et al., 2005).
Em relação às células T CD8+CD25-, os antígenos analisados também foram capazes de aumentar a frequência destas células expressando Foxp3+, no total dos indivíduos analisados.
Avaliamos também neste estudo o perfil das células TCD8+ frente aos antígenos do Schistosoma spp. Houve um aumento da frequência das células TCD8+ regulatórias (TCD8+CD25High) na presença dos antígenos no total dos indivíduos e nos indivíduos com HAM/TSP. Adicionalmente, a frequência de células regulatórias expressando Foxp3 (CD8+CD25HighFoxp3+) aumentou em todos os indivíduos analisados.
Já havíamos demonstrado que antígenos do Schistosoma spp. são capazes de levar a diminuição da produção de IFN-y in vitro e ao aumento de IL-10 pelas CMSP (Lima, L. M. et al., 2013) e, observamos também que as células T com perfil modulatório (TCD4+ e TCD8+) parecem estar associadas a este processo.
Alguns estudos tem demonstrado que antígenos de helmintos induzem a produção de IL-10 por macrófagos em modelo de asma e colite aguda. A depleção destas células reverte este efeito, mostrando que os macrófagos, além das células Treg são as principais responsáveis pela produção de IL-10 após tratamento com antígenos parasitários (Schnoeller, C. et al., 2008).
A fonte produtora de IL-10 foi também avaliada no presente estudo, uma vez que esta é uma importante citocina modulatória e que é altamente produzida pela adição dos antígenos do Schistosoma spp. avaliados neste estudo (Lima, L. M. et al., 2013). Foi observado que os monócitos são a principal fonte produtora de IL-10 nos indivíduos infectados pelo HTLV-1, seguido pelas células TCD4+, TCD8+ e linfócitos B. Esse estudo mostrou, também, que nos indivíduos com HAM/TSP existe uma tendência para que os monócitos, juntamente com as células CD8+ sejam as principais fontes produtoras de IL-10.
Tem sido demonstrado que a produção de IL-10 é maior em indivíduos com HTLV-1 em relação aos indivíduos não infectados (Carvalho, E. M. et al., 2001) e que essa produção é maior nos indivíduos portadores em relação aos indivíduos com HAM/TSP (Santos, S. B. et al., 2004). A adição de IL-10 em estudos in vitro resultou na diminuição da produção de IFN-y pelas CMSP de indivíduos portadores do vírus (Santos, S. B. et al., 2006). Essas são evidências de que a IL-10 é uma citocida chave no controle do processo inflamatório induzido pelo HTLV-1.
Existe também a documentação de mais alta frequência de células TCD8+ expressando IL-10 nos portadores do HTLV-1 coinfectados com helmintos, em relação aos não coinfectados (Porto, A. F. et al., 2005). Os antígenos do Schistosoma spp utilizados no presente estudo foram também eficientes em
aumentar a produção de IL-10 pelas células CD4+, CD8+ e monócitos, nos indivíduos com HTLV-1.
CONCLUSÃO
Os antígenos do Schistosoma spp utilizados neste estudo foram capazes de modular negativamente a resposta imune exacerbada do tipo Th1 in vitro em uma alta porcentagem de indivíduos infectados pelo HTLV-1. Esta modulação foi coincidente com o aumento da produção de IL-10, citocina esta produzida principalmente pelas células Treg e monócitos. Estes achados podem contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias para a prevenção do processo inflamatório induzido pela infecção pelo HTLV-1 e a cosequente progressão para as formas mais graves da doença, a exemplo da HAM/TSP.
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