Para o processo de FSm foram analisadas a influência da relação massa/volume (m/v) da concentração do substrato (1, 3 e 5 %) e o teor de farelo de trigo (0, 25 e 50 %) compondo o substrato, durante as cinéticas de fermentação para cada experimento, com duração de 240 horas cada. Nas Figuras 4.12 e 4.16 são apresentados os perfis cinéticos para a produção das enzimas CMCase e Xilanase, referente ao planejamento experimental da Tabela 3.4.
4.4.1 CMCase
4.4.1.1 Perfil Cinético da produção de CMCase
Na Figura 4.12, estão apresentadas as cinéticas fermentativas de produção da enzima CMCase pela FSm, para os ensaios do planejamento experimental.
Figura 4.12 - Cinética da Fermentação Submersa para produção da enzima CMCase.
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 m/v = 1%;FT = 0% m/v = 5%;FT = 0% m/v = 1%;FT = 50% m/v = 5%;FT = 50% m/v = 3%;FT = 25% m/v = 3%;FT = 25% m/v = 3%;FT = 25% C MC a se (U /mL ) Tempo (h)
Observa-se na Figura 4.12 para os ensaios 1 e 2, com 1 e 5 % de concentração do substrato (m/v) e compostos apenas por BSS, apresentaram máximas atividade de CMCase de 0,31 U/mL em 168 h e 0,96 U/mL em 144 h de fermentação, respectivamente. A partir desses valores observa-se que a concentração do substrato (m/v) teve influência na atividade da Xilanase para os ensaios apenas com BSS, uma vez que a atividade para o ensaio 2 foi 3 vezes maior que à obtida no ensaio 1.
Analisando o ensaio 3, onde foi utilizado como substrato o BSS com 50 % de FT, e concentração do substrato (m/v) de 1 %, apresentou atividade máxima de 0,35 U/mL em 144 h de fermentação. Para o ensaio 4, com substrato composto por BSS e 50 % de FT, e concentração do substrato (m/v) de 5 %, o processo de produção da CMCase foi crescente, não apresentando um pico, e sim maior atividadede 1,50 U/mL nas 216 h de fermentação, indicando que se aumentássemos o tempo de fermentação poderíamos ainda ter um aumento na atividade.
Comparando os ensaios 1 e 3, podemos observar que para a concentração do substrato de 1 % (m/v), o % de FT na composição do substrato, variando de 0 % para 50 % de FT, praticamente não teve influência na atividade enzimática da CMCase.
Comparando os ensaios 2 e 4 observa-se que até o tempo de 144 h a produção de CMCase foi maior para a concentração de 1 %. A partir de 168 h de fermentação que a atividade começa a ser mais expressiva para a concentração de 5 %, chegando a um aumento de 1,5 vezes na produção da enzima CMCase nas 216 h.
Os ensaios 5, 6 e 7, com concentração do substrato de 3 % (m/v) e o teor de farelo de trigo de 25 %, apresentaram aproximadamente o mesmo perfil cinético e máxima atividade de 1,12 U/mL em 144 horas de fermentação, comprovando há reprodutibilidade e repetibilidade do processo fermentativo.
Salomão (2017) estudando as melhores condições operacionais de temperatura (28, 33 ou 38 ºC) e concentração de bagaço de cana (0,5, 1,6 ou 2,7 %) para produção de celulases a partir dos fungos Penicillium sp., Rhizomucor sp. e Trichoderma koningii INCQS 40331 (CFAM 422) utilizando bagaço de cana in natura e pré-tratado com solução ácido-base por FSm, obteve o melhor resultado para a atividade da CMCase com o fungo Trichoderma koningii a 28 ºC e concentração de substrato in natura de 2,7 % de 3,130 U/mL em 72 h. Já para o bagaço pré-tratado o melhor resultado foi á 28 ºC e 0,5 % de substrato com uma atividade de 1,52 U/mL, valor semelhante ao encontrado neste trabalho para a concentração de 5 % e 50 % de FT.
Albano (2012) trabalhou com 6 linhagens de fungos filamentosos, incluindo A. fumigatus e T. reesei, utilizando como substrato bagaço de cana-de-açúcar na produção de celulases e xilanases por FSm com concentração de substrato de 3 %. Para os fungos A. fumigatus e T. reesei as atividades máximas de CMCase foram de 17, 4 e 10,7 U/g, respectivamente. Valores inferiores aos encontrados neste trabalho, usando apenas o BSS como substrato nas concentrações de 1 e 5 %.
4.4.1.2 Análise Estatística da produção de CMCase
Para a análise estatística do planejamento experimental na produção de CMCase na FSm, as atividades enzimáticas selecionadas para compor a matriz do planejamento como variável resposta, foram as obtidas no tempo de 216 horas, por ser esse o tempo de obtenção de maior atividade (ensaio 4), no entanto, ressalta-se que não necessariamente a atividade enzimática foi a de valor máximo para os demais ensaios, nesse tempo.
A Tabela 4.10 mostra os dados do planejamento experimental e como variável resposta as atividades de CMCase no tempo de 216 horas de fermentação.
Tabela 4.10 - Ensaios do planejamento experimental para a produção de CMCase em 216 h na FSm Ensaios m/v % FT % CMCase U/mL U/g 1 1 (-1) 0 (-1) 0,226 22,60 2 5 (+1) 0 (-1) 0,9343 18,69 3 1 (-1) 50 (+1) 0,3288 32,88 4 5 (+1) 50 (+1) 1,4994 29,99 5 3 (0) 25 (0) 0,9539 32,79 6 3 (0) 25 (0) 1,024 34,13 7 3 (0) 25 (0) 0,9897 32,98
Na Figura 4.13 é apresentado o Diagrama de Pareto mostrando a influência da concentração do substrato (m/v) e o teor de farelo de trigo (FT) na produção da enzima CMCase e o efeito da interação entre essas duas variáveis (m/v.FT).
Figura 4.13 - Diagrama de Pareto para a produção de CMCase em 216 horas.
Fica evidente que as duas variáveis estudadas e a interação entre elas são parâmetros estatisticamente significativos no processo da FSm, influenciando positivamente na obtenção de atividade celulolítica. A concentração do substrato (% m/v) foi a variável que mais influenciou no processo. Quando passamos do nível -1 (menor % m/v) para o nível +1 (maior % m/v), ocorre o aumento da atividade enzimática da CMCase.
Na Figura 4.14 é apresentado o gráfico de dispersão entre os valores previstos pelo modelo estatístico e os valores observados para cada ensaio do planejamento experimental.
Figura 4.14 – Gráfico dos valores preditivos versus valores observados para a produção de CMCase em 216 horas.
A partir dos dados observados constata-se uma excelente concordância entre os valores observados e os esperados, confirmando o modelo como linear, onde os resíduos do modelo seguem distribuição normal, visto que os pontos se aproximam da reta identidade.
Na Tabela 4.11 observa-se a análise de variância para os resultados de atividade enzimática da CMCase do planejamento experimental.
Tabela 4.11 - Análise de Variância (ANOVA) para a produção de CMCase em 216 horas.
Fonte de variação SQ GL MQ Teste F
Regressão 1,047519228 3 0,3492 1,10
Resíduo 0,102915047 3 0,0343
Total 1,140434 6
% R2 91,05
Ftabelado = 9,28 Fcalculado =10,18
GL – Grau de Liberdade; SQ - Soma dos Quadrados; MQ. – Média Quadrática dos Desvios; Teste F = (Fcalculado / Ftabelado).
Os dados foram analisados em nível estatístico de 95 % de confiança apresentando um coeficiente de determinação (porcentagem de variação explicada) de 91,05 %.
Segundo Barros Neto et al. (1995) para valores de F maior que 1,0 o modelo estatístico é considerado significativo. Neste caso para a produção de CMCase o modelo é significativo ao nível de 95 % de confiança, uma vez que o valor de F foi de 1,10.
O modelo estatístico codificado com as variáveis significativas para a atividade enzimática da CMCase é apresentado na Equação 4.3.
𝐶𝑀𝐶𝑎𝑠𝑒 (𝑈 𝑚𝐿⁄ ) = 0,850 + 0,470 𝑚/𝑣 + 0,167 𝐹𝑇 + 0,116 𝑚/𝑣. 𝐹𝑇 (4.3)
A Figura 4.15 apresenta a superfície de resposta para a variável atividade enzimática da CMCase em função da concentração do substrato (% m/v) e do teor de farelo de trigo adicionado ao BSS, usado como substrato na fermentação submersa. Observa-se que nos intervalos estudados a maior atividade enzimática da CMCase ocorre para o nível +1 da concentração do substrato (% m/v) e o nível +1 do teor de farelo de trigo (FT %).
Figura 4.15 - Superfície de resposta para a produção de CMCase em 72 horas.
Observa-se que o aumento da concentração do substrato (% m/v) e o aumento do teor de farelo de trigo (FT %), fonte adicional de nitrogênio, propicia um aumento na atividade enzimática, onde se operando nos níveis +1 (5 % m/v) e +1 (50 % FT) para estas variáveis, respectivamente, obtém-se atividades enzimáticas acima de 1,50 U/mL.
4.4.2 Xilanase
4.4.2.1 Perfil Cinético da produção Xilanase
Na Figura 4.16, estão apresentadas as cinéticas fermentativas de produção da enzima Xilanase pela FSm, para os ensaios do planejamento experimental.
Figura 4.16 - Cinética da Fermentação Submersa para produção da enzima Xilanase. 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 0 10 20 30 40 50 60 70 80 m/v = 1%;FT = 0% m/v = 5%;FT = 0% m/v = 1%;FT = 50% m/v = 5%;FT = 50% m/v = 3%;FT = 25% m/v = 3%;FT = 25% m/v = 3%;FT = 25% Xi la n a se (U /mL ) Tempo (h)
Observa-se na Figura 4.16 para os ensaios 1 e 2, com 1 e 5 % de concentração do substrato (m/v) e compostos apenas por BSS, ambos apresentaram picos de atividade em 168 h de fermentação de 12,58 e 30,29 U/mL de Xilanase, respectivamente. A partir desses valores observa-se que, a concentração do substrato (m/v) teve influência na atividade da Xilanase para os ensaios apenas com BSS, uma vez que a atividade para o ensaio 2 foi mais que 2 vezes superior à obtida no ensaio 1, para o mesmo tempo de atividade máxima.
Analisando o ensaio 3, onde foi utilizado como substrato o BSS com 50 % de FT, e concentração do substrato (m/v) de 1 %, observa-se que o perfil cinético apresentou um pico de atividade máxima de 12,79 U/mL em 48 h de fermentação. Já o ensaio 4, com substrato composto por BSS e 50 % de FT, e concentração do substrato (m/v) de 5 %, apresentou o maior pico de atividade e maior produtividade para a produção da Xilanase de 76,68 U/mL em 192 h de fermentação, com produtividade de 0,399 U/mL.h.
Comparando os ensaios 1 e 3, pode-se observar que para a concentração do substrato de 1 % (m/v), o % de FT na composição do substrato, variando de 0 % para 50 % de FT, praticamente não teve influência na atividade enzimática da Xilanase. Comparando os ensaios2 e 4 com concentração do substrato de 5 %, teve-se um aumento de 2,5 vezes na produção da enzima Xilanase.
Os ensaios 5, 6 e 7, com concentração do substrato de 3 % (m/v) e o teor de farelo de trigo de 25 %, apresentaram aproximadamente o mesmo perfil cinético e máxima atividade de 26,90 U/mL em 144 horas de fermentação, demostrando novamente que o processo fermentativo desenvolvido nessa pesquisa foi reprodutível.
Silva et al. (2018) estudaram a produção de enzimas celulases e xilanases, utilizando Trichoderma reesei QM9414 no processo de FSm, com concentração de substrato de 3 %, e obtiveram uma máxima atividade de Xilanase de 93,08 U/mL (0,387 U/mL.h) utilizando o bagaço de cana-de-açúcar sob pré-tratamento alcalino em 240 h de fermentação. Valor acima do encontrado neste trabalho para o ensaio com 5 % mas com menor produtividade.
Florencio et al. (2016) estudando o efeito dos processos de fermentação, submersa (FSm) e sequencial (FSL), sobre a produção de enzimas utilizando como substrato o bagaço de cana pré-tratado por explosão a vapor (concentração de 1 %) e glicose (10 g/L), obtiveram atividades de xilanase na FSL maiores que as produzidas por FSm. Utilizando o Trichoderma reesei Rut C30, as máximas atividades para a FSm e FSL foram de 7,9 e 18,3 U/mL, respectivamente, e usando o fungo Aspergillus niger A12, as máximas atividades de xilanase foram de 7,8 e 26,4 U/mL para a FSm e FSL, respectivamente. Valores para a FSm inferiores ao encontrado nesse trabalho para os ensaios apenas com BSS e concentração de substrato de 1 %. Já para a FSL os valores foram próximos aos encontrados neste trabalho com concentração de 3 % e 25 % de FT.
Dutra (2013) estudou a influência de várias fontes de carbono na indução de celulases e hemicelulases utilizando o fungo Chrysoporthe cubensis, fungo patógeno de eucalipto, na FSm. O C. cubensis produziu os maiores níveis de atividades celulolíticas e hemicelulolíticas quando crescido em farelo de trigo e CMC (concentração de 1 % m/v), com valores de máximas atividades de Xilanase de 14,2 U/mL e 10,7 U/mL, respectivamente.
4.4.2.2 Análise Estatística da produção de Xilanase
Para a análise estatística do planejamento experimental na produção de Xilanase na FSm, as atividades enzimáticas selecionadas para compor a matriz do planejamento como variável resposta, foram as obtidas no tempo de 192 horas, tempo de obtenção de maior atividade (ensaio 4), que não necessariamente foi o tempo, de maior atividade para os demais ensaios.
Tabela 4.12 mostra os dados do planejamento experimental e como variável resposta as atividades de Xilanase no tempo de 192 horas de fermentação
Tabela 4.12 - Ensaios do planejamento experimental para a produção de Xilanase em 192 h na FSm. Ensaios m/v % FT % Xilanase U/mL U/g 1 1 (-1) 0 (-1) 10,59 1058,54 2 5 (+1) 0 (-1) 28,15 563,05 3 1 (-1) 50 (+1) 10,37 1037,39 4 5 (+1) 50 (+1) 76,68 1533,53 5 3 (0) 25 (0) 25,00 833,33 6 3 (0) 25 (0) 31,32 1043,81 7 3 (0) 25 (0) 28,16 938,57
Na Figura 4.17 é apresentado o Diagrama de Pareto mostrando a influência da concentração do substrato (m/v) e o teor de farelo de trigo (FT) na produção da enzima Xilanase e o efeito da interação entre essas duas variáveis.
Figura 4.17 - Diagrama de Pareto para a produção de CMCase em 216 horas.
Observa-se que as duas variáveis estudadas e a interação entre elas são parâmetros estatisticamente significativos no processo da FSm, influenciando positivamente na obtenção de atividade xilanolítica. A concentração do substrato (% m/v) foi a variável que mais influenciou no processo. Quando passamos do nível -1 (menor % m/v) para o nível +1 (maior % m/v), ocorre o aumentando da atividade enzimática da Xilanase.
Na Figura 4.18 é apresentado o gráfico de dispersão entre os valores previstos pelo modelo estatístico e os valores observados para cada ensaio do planejamento experimental.
Figura 4.18 – Gráfico dos valores preditivos versus valores observados para a produção de Xilanase em 192 horas.
A partir dos dados observados constata-se uma excelente concordância entre os valores observados e os esperados, onde os resíduos do modelo seguem distribuição normal, visto que os pontos se aproximam da reta identidade, confirmando o modelo como linear.
Na Tabela 4.13 observa-se a análise de variância para os resultados de atividade enzimática da Xilanase do planejamento experimental.
Tabela 4.13 - Análise de Variância (ANOVA) para a produção de Xilanase em 192 horas.
Fonte de variação SQ GL MQ Teste F
Regressão 2935,851027 3 978,6170 8,23
Resíduo 38,46307842 3 12,8210
Total 2974,314 6
% R2 98,70
Ftabelado = 9,28 Fcalculado = 76,33
GL – Grau de Liberdade; SQ - Soma dos Quadrados; MQ. – Média Quadrática dos Desvios; Teste F = (Fcalculado / Ftabelado).
Os dados foram analisados em nível estatístico de 95 % de confiança apresentando um coeficiente de determinação de 98,70 %, percentual de variações explicadas pelo modelo.
Segundo Barros Neto et al. (1995) para valores de F maior que 1,0 o modelo estatístico é considerado significativo, indicando que há relação entre as variáveis independentes e dependentes. Para que um modelo não seja apenas estatisticamente significativo, mas também útil para fins preditivos, o valor do teste F deve ser no mínimo maior que 4,0. Neste caso para a produção de Xilanase o modelo é significativo e preditivo ao nível de 95 % de confiança, uma vez que o valor de F foi de 8,23. O modelo estatístico codificado com as variáveis significativas para a atividade enzimática da CMCase é apresentado na Equação 4.4.
𝑋𝑖𝑙𝑎𝑛𝑎𝑠𝑒 (𝑈 𝑚𝐿⁄ ) = 30,038 + 20,967 𝑚/𝑣 + 12,078 𝐹𝑇 + 12,184 𝑚/𝑣. 𝐹𝑇 (4.4)
A Figura 4.19 apresenta a superfície de resposta para a variável atividade enzimática da Xilanase em função da concentração do substrato (% m/v) e do teor de farelo de trigo adicionado ao BSS, usado como substrato na fermentação submersa. Observa-se que nos intervalos estudados a maior atividade enzimática da Xilanase ocorre para o nível +1 da concentração do substrato (% m/v) e o nível +1 do teor de farelo de trigo (FT %).
Verifica-se a grande influência que a concentração do substrato tem na produção de Xilanase e que também a suplementação do BSS com farelo de trigo, contribui para o aumento da atividade da Xilanase produzida por Thichoderma reesei LCB 048.