Produção de ɣ-PGA em Biorreator de 5 L

Com o objetivo de aumentar a escala do processo de produção do ɣ-PGA por Bacillus velezensis NRRL-23189, duas fermentações foram realizadas utilizando as diferentes fontes de carbono estudadas anteriormente, glicerol residual ou melaço. Os cultivos foram conduzidos em fermentador Bio Flow III com cuba de 5 L.

As fermentações foram conduzidas por 96 h utilizando as condições otimizadas pelos DCCR, ou seja, 27 ⁰C, pHinicial de 6,5. A taxa de aeração utilizada

foi de 2 VVM com velocidade de agitação de 500 rpm, de forma a manter a concentração necessária de oxigênio dissolvido, uma vez que em ensaios preliminares com taxa de aeração de 1 VVM e rotação de 200 rpm não ocorreu produção do ɣ-PGA. Tais mudanças ocorreram para melhorar a aeração do sistema e evitar a queda do oxigênio dissolvido. Segundo Zhang e colaboradores (2011) a velocidade de agitação e taxa de aeração influenciam o nível do oxigênio no meio durante a fermentação. Sabemos que Bacillus species são micro- organismos aeróbios e o suplemento do oxigênio é um fator importante para fermentação aeróbica (Richard; Margaritis, 2003b).

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As análises foram feitas em duplicata e os resultados de cinética da produção de ɣ-PGA usando glicerol ou melaço como fonte de carbono estão demonstrados nas Figuras 36 e 37.

Figura 36. Cinética da produção do ɣ-PGA utilizando glicerol da fabricação

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Figura 37. Cinética da produção do ɣ-PGA utilizando melaço como fonte de

carbono e Bacillus velezensis NRRL B-23189

A Figura 36 mostra que a concentração de biomassa aumentou rapidamente, enquanto a concentração de ɣ-PGA começou a aparecer por volta de 12 horas de fermentação, ou seja, a produção de ɣ-PGA não ocorreu de forma associado ao crescimento celular quando se utilizou glicerol com fonte de carbono. Quando se utilizou melaço este comportamento não foi observado (Figura 37), mas sim produção de ɣ-PGA associada ao crescimento celular. Em ambas as fermentações ocorreu queda da concentração de ɣ-PGA, indicando que ele foi degradado enzimaticamente, provavelmente para ser utilizado como substrato. A concentração de oxigênio dissolvido manteve-se ao redor de 10% da saturação no ensaio da Figura 36 após 10 horas de fermentação e pouco acima de 20% após 40 horas de fermentação no ensaio da Figura 37, o que pode ser explicado pelo seu consumo e aumento da viscosidade do meio de cultura causado pela presença do ɣ-PGA, que dificultou a transferência do oxigênio da fase gás para a líquida. Segundo Chen e colaboradores (2010), o aumento da concentração do ɣ- PGA de alto peso molecular no meio fermentativo, aumenta a viscosidade do meio. Os autores também observaram que quando se utilizou alta concentração

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de glicose, ou seja 120 g/L, uma alta concentração de ɣ-PGA, aproximadamente 46,4 g/L, foi obtida em 48 h de fermentação. Após este tempo, a produção do ɣ- PGA começou a decair, a viscosidade aumentou e a concentração de oxigênio dissolvido diminuiu. Outro fator que pode ter influenciado é que a biossíntese do ɣ- PGA foi reduzida rapidamente quando a glicose estava esgotada no meio fermentativo, assim a produção do ɣ-PGA foi afetada pela disponibilidade de glicose. Assim, o micro-organismo ao sofrer estresse por falta do substrato procurou uma nova fonte de carbono que seria o ɣ-PGA. Segundo Chen e colaboradoes (2010), a biossíntese do ɣ-PGA foi reduzida rapidamente quando glicose estava esgotada no meio fermentativo, assim a produção do ɣ-PGA foi afetada pela disponibilidade de glicose.

Como podemos observar na Figura 37, a concentração de ART no meio contendo melaço residual apresentou queda continua durante todo o processo fermentativo, no entanto após determinada concentração, aproximadamente 60 g/L do melaço residual, o micro-organismo começou a utilizar também o ɣ-PGA como fonte de carbono para sua sobrevivência, demonstrado pela queda após 48 h de fermentação na linha que representa a concentração do ɣ-PGA.

Um fato importante a ser observado é a diferença final da concentração do ɣ-PGA entre ambas as fermentações. Utilizando glicerol oriundo da fabricação do biodiesel como fonte de carbono a concentração do ɣ-PGA chegou a 27,08 g/L em 48 h de fermentação. Já utilizando o melaço, a concentração do ɣ-PGA não ultrapassou 6,69 g/L, também obtido em 48 h. Esta diferença não foi encontrada quando as fermentações ocorreram em frascos de Erlenmeyers de 250 mL. Sugere-se que tal diferença tenha ocorrida devido à presença de muitas impurezas no melaço e/ou às condições operacionais empregadas no fermentador e/ou diferença na concentração do ácido cítrico utilizado, pois este participa do ciclo do ácido tricarboxílico que produz ɣ-PGA (GOTO; KUNIOKA, 1992).

Comparando os resultados acima com os obtidos por Shi e colaboradores (2006b), podemos observar que as concentrações de ɣ-PGA alcançadas neste

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trabalho foram menores porem satisfatórias, considerando que esses autores usaram na composição do meio sacarose como substrato, 59,8 g/L, triptona, 53,54 g/L e ácido glutâmico, 81,05 g/L, para obter 58,2 g/L do ɣ-PGA. No entanto esta produção foi realizada empregando substratos onerosos que aumentaram o custo de produção. Já neste trabalho utilizou-se subprodutos industriais brasileiros, sulfato de amônio, sem a presença do ácido glutâmico, chegando a obter 27,08 g/L do ɣ-PGA. É importante salientar que quando utilizaram sulfato de amônio, mesmo componente utilizado neste trabalho como fonte de nitrogênio, esses autores não conseguiram produzir ɣ-PGA. Resultado similar foi observado por Chen e colaboradores (2010).

Zhang e colaboradores (2011) conseguiram produzir aproximadamente 34,4 g/L de ɣ-PGA utilizando a mesma concentração do sulfato de amônio, glicose como fonte de carbono e ácido glutâmico na concentração de 50 g/L, sendo apropriada a mesma comparação com relação ao menor custo do meio de cultura utilizado neste trabalho, a despeito da menor concentração de ɣ-PGA produzido. É importante salientar esses autores fizeram um estudo relacionando a influência da aeração no processo fermentativo, alcançando a concentração de ɣ-PGA mencionada acima com agitação de 600 rpm. Quando utilizaram agitação de 800 rpm, a concentração de ɣ-PGA caiu para 29,1 g/L. Concluíram que é melhor usar velocidade de agitação menor nas primeiras 24 h, para aumentar o número de células, e depois um valor maior para produzir do ɣ-PGA.

Trabalho similar foi realizado por Bajaj e Singhal (2009) com o objetivo de estudar a adição de precursores (aminoácidos e intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico) na produção do ɣ-PGA. O meio de composição semelhante ao estudado neste trabalho diferenciava por apresentar o glicerol industrial e ácido glutâmico em concentração de 20 g/L, além da adição de outros precursores. A concentração de ɣ-PGA obtido foi de 35,75 g/L, quando foram adicionados os precursores e 26,12 g/L quando estes estavam ausentes. Observa-se então que com a adição de precursores a produção de ɣ-PGA foi maior que a obtida neste trabalho, porém sem a adição deste componente não houve diferença signiticativa.

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