Produção de Enzimas por Fermentação em Estado Semissólido

Para se avaliar a produção de enzimas celulolíticas usando a palma forrageira como substrato, uma fermentação em estado semissólido foi realizada.

Foi testada apenas a espécie de palma com maior teor de celulose em seu estado in- natura e também após pré-tratamento hidrotérmico, que consistiu em pesar 40 g do material lignocelulósico adicionado 400 mL de água destilada e levar para autoclave, onde permaneceu por 30 minutos a 121 °C. O material obtido passou por sucessivas lavagens, havendo o controle do pH e da cor aparente da água filtrada que, tornando-se constantes, determinavam o fim desta etapa. O material pré-tratado foi seco em estufa com circulação forçada de ar a 70 °C por dois dias e, em seguida, estocado em recipiente fechado a temperatura ambiente e com baixa umidade.

3.5.1. Microrganismo

A fim de testar o uso da palma forrageira como substrato para produção de celulase, foi testado o fungo filamentoso Penicillium chrysogenum (807) da coleção ARS Culture Collection – BFPM Research Unit, National Center for Agriculture Utilization Research. O fungo, inicialmente liofilizado, foi hidratado com 2 mL de água deionizada, inoculado em placas de Petri contendo meio BDA (extrato de batata-dextrose-ágar) e incubado por 7 dias a 28 °C, sendo feito um repique ao final do período para outra placa de mesma composição.

3.5.1.1. Obtenção dos esporos

Os esporos obtidos após o segundo repique em meio BDA foram inoculados em meio de sabugo de milho de acordo com Guilherme et al. (2008). O meio era composto por 4,6 g de sabugo de milho seco e moído (aproximadamente 3 mm) adicionado em Erlenmeyer de 125 mL e esterilizado em autoclave (1 hora a 121 °C). Antes de inocular os esporos, 6 mL de uma solução umidificante (solução de nutrientes) foram adicionadas ao sabugo. A fim de preparar a solução umidificante, foi preparada 100 mL de solução de fosfato de potássio monobásico 200 g/L (solução A), 100 mL de solução B contendo 3,96 g de sulfato de zinco heptahidratado e 4,6 g de sulfato de ferro II heptahidratado e 50 mL de solução 56 g/L de peptona. As soluções foram autoclavadas (20 min a 121 °C) e, posteriormente, 0,19 mL da solução A e 0,025 mL da solução B foram adicionadas às 50 mL da solução peptonada.

Para inoculação do microrganismo, transferiu-se 1 mL de solução Tween 80 a 0,2% (p/v) para as placas contendo o fungo. Com o auxílio de uma ponteira, raspou-se a superfície do meio com o objetivo de descolar os esporos aderidos ao meio BDA. Coletou-se 1 mL da solução de Tween contendo esporos e transferiu-se para o meio com sabugo, tomando-se o cuidado de distribuí-lo bem por todo o substrato. Os esporos foram mantidos em câmara incubadora para DBO a 30 °C por cinco dias.

3.5.1.2. Contagem de esporos com câmara de Neubauer

Seguindo a metodologia descrita por Couri &Farias (1995), uma suspensão de esporos do fungo foi preparada pela adição de 20 mL de água destilada estéril contendo Tween 80 a 0,5% (p/v) no Erlenmeyer onde ocorreu o crescimento dos esporos em sabugo de milho, sendo a mistura submetida à agitação manual para uma eficiente extração dos esporos.

Uma alíquota de 1 mL era retirada e diluída em solução de Tween 80 0,2% (p/v). Um volume de 100 µL da suspensão de esporos diluída era transferido para cada lado da câmara de Neubauer previamente limpa com etanol 70% onde se procedia a contagem.

A câmara de Neubauer é composta por uma lâmina de vidro fina com duas áreas de contagem com 0,1 mm de profundidade. Cada câmara é dividida em 9 quadrados grandes. O quadrado grande central é subdividido em 25 quadrados médios sendo cada um destes últimos subdivididos em 16 quadrados menores de 9 mm² cada.

Os esporos que estavam dentro da área do quadrado grande central, incluindo aqueles que estavam sobre as linhas superiores e direitas do perímetro externo do quadrado médio foram contados sob um microscópio (objetiva de 40x). A quantidade de esporos total contada dos dois lados foi dividida por 2 e multiplicada pelo fator 10000 para transformar o volume e se determinar o número de esporos presentes por mL de suspensão e pelo fator de diluição, de acordo com a Equação (3.17).

[ ] (3.17)

3.5.2. Condições da FES

A solução salina para umidificação da biomassa era composta por sulfato de amônio (0,1%), nitrato de amônio (0,1%) e sulfato de magnésio heptahidratado 0,1% (p/v), com pH corrigido para 3, 5 e 7 com ácido clorídrico (3 M) ou hidróxido de sódio (0,1 M).

Usando-se frascos Erlenmeyers de 250 mL, foram adicionados 5 g da matéria-prima em base seca 5 mL de inóculo, contendo os esporos de P. chrysogenum e 5 mL de solução salina para se obter umidade final de 66%. O inóculo formado pela suspensão obtida do meio de sabugo de milho foi diluído em Tween 80 0,2% (p/v) para atingir concentração de 1,0 x 106 esporos/mL, seguindo metodologia proposta por Coelho et al. (2001).

Os frascos foram incubados em incubadora para DBO a 30 °C por cinco dias e, ao final deste período, procedia-se a extração enzimática.

3.5.3. Extração das Enzimas

Um volume de 20 mL de tampão acetato 0,2 M pH 4,5 foi adicionado aos frascos que, em seguida, foram mantidos em banho termostático a 30 °C por 1 h, com agitação manual usando bastão de vidro a cada dez minutos. Para separar o sólido do sobrenadante, o material foi centrifugado em tubos Falcon a 3000 rpm por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi armazenado em tubos Eppendorf e mantido a -4 °C. Procedeu-se, então a análise das atividades enzimáticas de FPase (subitem 3.4.2.1) e CMCase.

3.5.4. Determinação da Atividade Enzimática de CMCase

A metodologia de determinação de CMCase ocorreu de acordo com a metodologia adaptada de Ghose (1987). Uma solução de carboximetilcelulose (CMC) 4% (p/v) foi preparada em tampão citrato de sódio 50 mM (pH 4,8). Uma alíquota de 1 mL desta solução foi adicionada em tubo de ensaio e levada a banho termostático a 50 °C por 1 minuto para equilibrar a temperatura. O mesmo volume (1 mL) de solução enzimática foi adicionado e a mistura foi incubada no banho a 50 °C por 15 minutos. A solução final foi analisada pelo método do DNS, usando a solução de CMC como branco. Assim como na FPase, o teor de açúcar na solução enzimática antes da reação foi determinado realizando-se, para tanto, a mesma diluição com tampão citrato de sódio 50 mM pH 4,8 que foi realizado na mistura reacional com a solução de CMC. A equação para determinação da atividade de CMCase, em UI/mL, é semelhante àquela usada para o cálculo da FPase, sendo o valor de volume reacional de 2 mL, o tempo de reação de 15 min e o volume de solução enzimática de 1 mL.

3.5.5. Cálculo da atividade enzimática por massa de material utilizado

As atividades calculadas foram comparadas de acordo com a quantidade de biomassa lignocelulósica utilizada. Para tanto, o valor de atividade encontrado foi multiplicado pelo volume total e dividido pela massa de palma adicionada aos Erlenmeyers, conforme a Equação (3.18).

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CAPÍTULO IV