88
RESUMO
Os biopolímeros microbianos têm sido aplicados em diversos setores da indústria. Dentre esses biopolímeros de aplicações diversas destacam se o polihibutirato (PHB) sintetizados por bactérias e utilizados como reserva de carbono pela célula e os exopolissacarídeos (EPS) e diversas enzimas. A espécie utilizada pela indústria para a produção de PHB é Ralstonia eutropha, embora diversas bactérias do solo, como rizóbios tenham essa habilidade, representando fontes alternativas para a produção de destes materiais. Os EPS são produzidos principalmente por estirpes de Xanthomonas spp. O objetivo deste estudo foi avaliar a produção de PHB e EPS por bactérias de nódulos de guandu. Foram cultivados 37 desses isolados em meio de cultura YEM líquido e a detecção do PHB foi realizada através da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os três isolados que produziram maior quantidade de PHB, foram selecionados para a avaliação da produção de deste polímero após crescimento em meio de cultura suplementado com seis fontes de carbono. Os EPS foram produzidos pelas bactérias em meio líquido, quantificados e avaliados reologicamente. A produção de amilases pela coloração de tintura de iodo também foi avaliada em outro ensaio. Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado com três repetições. Dos isolados testados cinco foram capazes de produzir mais de 10 mg de PHB por litro meio de cultura, e ainda produzirem altas concentrações totais de PHB (cerca de 50% da total biomassa). O cultivo de isolados em diferentes fontes de carbono demonstrou que a melhor fonte de carbono para a produção total de PHB foi o manitol, porém fontes como o amido e a xilose também se destacaram tanto para a produção de PHB como para a produção de EPS. As bactérias apresentaram elevada variabilidade quanto à produção de EPS, tendo forte influência da fonte de carbono. Os EPS selecionados para as análises reológicas apresentaram um comportamento não-newtoniano pseudoplástico, embora tenha havido diferenças entre os isolados. Com relação à produção de amilases os um isolado se destacou bastante dos demais onde a halo de degradação do amido atingiu mais de 2,7 vezes o tamanho da colônia. Estes resultados demonstram o potencial biotecnológico dessas bactérias para a produção de biopolímeros.
Palavras chave: Biopolímeros. Inovação tecnológica. Reologia. Fluidos não-Newtonranos.
89
ABSTRACT
Microbial biopolymers had been applied in several industrial sectors. Among the polymers with several applications stands out the polyhydroxybutyrate (PHB) produced by bacteria and used as carbon reserve, the exopolysaccharides (EPS) and several enzymes. The specie used by the industry to produce the PHB is Ralstonia eutropha, in spite of several soil bacteria, such as rhizobia, that are able to produce this polymer. The EPS are produced principally by strains of Xanthomonas spp. The aim of this study was to evaluate the production of PHB, EPS and amylase by bacteria isolated from pigeonpea root nodules. There were cultured 37 isolates in YEM culture media and the detection of PHB was realized trough high precision liquid cromatography (HPLC). The three isolates that produced higher quantities of PHB were selected to evaluate the production of this polymer in culture media with other six carbon sources. The EPS produced by bacteria cultured in liquid media were quantified and rheologically evaluated. Furthermore, the amylolilitic activity was evaluated through staining with iodine solution in another assay. The experiments were conducted in a completely random design with three replications. Among the isolates tested five were able to produce more than 10 mg of PHB per liter of media and still produced high concentrations of total PHB (about 50% of total biomass). The cultivation of isolates showed that the better carbon source were the mannitol but other sources such as starch and xylose also pointed out either to the production of PHB and EPS. All bacteria presented high variability regarding the EPS production, with high influence of carbon source. The EPS selected to rheological analyses presented a non-Newtonian pseudoplastic behavior, despite of the differences observed among the isolates. The amylase production evaluation one isolate stands out where the degradation halo reached more than 2.7 folds the colony size. These results show the biotechnological potential of these bacteria for the biopolymers production.
Keywords: Biopolymers. Technological innovation. Rhelogy. Non-Newtonian fluids. High
90
2.1-INTRODUÇÃO
A utilização de recursos genéticos em vários ramos da indústria, como a farmacêutica, de alimentos, têxtil, dentre outros não é recente na história destas corporações. A aplicação dos insumos biológicos na indústria iniciou com a utilização de biomassa, principalmente vegetal, como na indústria têxtil, utilizando fibras de algodão, ou na indústria alimentícia com a utilização de amido, sacarose dentre outras substâncias oriundas da biomassa vegetal. Atualmente a utilização de biomassa nos ramos industriais ainda ocorre fortemente, porém hoje existe grande aplicação de microrganismos como catalisadores de processos industriais ou como biofábricas de moléculas de interesse (SUTHERLAND, 1998).
Diversos microrganismos são utilizados neste contexto, e três grupos de substâncias podem ser destacados os exopolissacarídeos (EPS), polihidroxibutirato (PHB) e enzimas hidrolíticas como as amilases, por exemplo. Os EPS são amplamente utilizados em indústrias de alimentos, cosméticos e farmacêutico, enquanto o PHB é utilizado principalmente na indústria dos termoplásticos. As amilases também apresentam aplicações principalmente na indústria alimentícia.
O Brasil vem desenvolvendo desde o final da década de 1980, um grande “know-how” para a produção de plásticos biodegradáveis, integrando a indústria sucro-alcoleira e a indústria de plásticos, através da seleção contínua de microrganismos e da aprimoração de métodos de produção, extração e purificação de PHB. Essa integração se deu através de um trabalho de cooperação entre A Coopersucar, a Universidade de São Paulo e o Instituto de Pesquisas Tecnológicas de São Paulo. Em 2001 a Coopersucar tinha a capacidade de produzir aproximadamente 10 mil toneladas de PHB por ano, a um custo de produção muito baixo (NONATO et al., 2001). Hoje a maior empresa produtora de PHB e outros polihidroxialcanoatos no Brasil é a Biocycle S.A., localizada no Estado de São Paulo, com a capacidade de produção de 30 mil toneladas de PHB por ano.
O EPS mais utilizado no Brasil é a goma xantana. Grande parte da goma xantana produzida no Brasil é importada, não havendo produção significativa no país, apesar de haver grupos de pesquisa com tradição e bastante estruturados na pesquisa de microrganismos mais capazes de produzir este polímero bem como a utilização de diversos substratos. Alemzadeh (2009) estima que os Estados Unidos, utilizem mais de 10 mil toneladas anuais de gomas produzidas a partir de EPS microbianos. Dessa forma a seleção de bactérias capazes de produzir estas moléculas é interessante do ponto de vista industrial e pode representar alternativas para setores da indústria, uma vez que há esse nicho vago no mercado brasileiro.
A produção de biopolímeros de interesse industrial, nas mesmas condições em que são cultivados os rizóbios na indústria de inoculantes no Brasil, pode representar uma atividade alternativa para este setor, uma vez que a produção de inoculantes no Brasil é muito dependente do plantio da soja, vendendo inoculantes entre o período de agosto a setembro, na época da semeadura desta cultura em todo o país.
No contexto da seleção, a prospecção de novos microrganismos que sejam capazes de incrementar a produção destes polímeros é importante e pode fornecer à indústria recursos genéticos com potencial para novas aplicações desses materiais. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de exopolisacarídeos, polihidroxibutirato e amilases por bactérias isoladas de guandu.
Este trabalho tem como hipótese científica: Isolados bacterianos oriundos de nódulos de guandu cultivado em diferentes solos e, isolados utilizando-se genótipos como planta-isca podem ser capazes de produzir elevadas quantidades de EPS e de PHB, podendo apresentar importantes aplicações biotecnológicas.
91
2.2-REVISÃO DE LITERATURA