Produção in vitro de embriões

4.3.1. Recuperação oocitária e maturação in vitro (MIV)

Ovários provenientes de abatedouro foram transportados para o laboratório em solução salina 0,9% a 28-32°C. Folículos entre 2 e 8mm foram aspirados utilizando agulha de 18 ga acoplada a seringa de 20mL. Oócitos com, no mínimo, 4 camadas de células do cumulus e citoplasma homogêneo foram selecionados para MIV. Grupos de 20 a 25 COCs foram maturados sob óleo mineral (Dow Corning Co., Midland, MI, EUA) em gotas de 100µL de meio de cultivo de tecidos (TCM 199, GIBCO BRL, Grand Island, NY, EUA) com sais de Earle, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB; Cripion, Andradina, SP, Brasil), 1,0µg/mL FSH (FolltropinTM, Bioniche Animal Health, Belleville, Ont, Canadá), 50µg/mL hCG (ProfasiTM, Serono, São Paulo, Brasil), 1,0µg/mL estradiol, 0,20mM piruvato de sódio e 83,4µg/mL amicacina (Instituto Biochimico, Rio de Janeiro, Brasil). Os COCs foram mantidos em estufa com atmosfera de 5% CO2em ar e temperatura de 38,5°C por 24 horas.

4.3.2. Fertilização in vitro (FIV)

Após 24 horas de MIV, COCs expandidos foram transferidos para gotas de 100µL de meio TALP-FIV suplementado com 6mg/mL de albumina sérica bovina (BSA), 30µg/mL de heparina, 18µM penicilamina, 10µM hipotaurina, 1,8µM epinefrina, 0,2 mM de piruvato de sódio e 83,4µg/mL de amicacina. Foi utilizado sêmen congelado de touro Nelore (B. indicus) e os espermatozóides móveis foram separados por gradiente de densidade em Percoll 45% e 90%. A concentração final de espermatozóides vivos foi de 1 x 105 por gota. Oócitos e espermatozóides foram co-incubados por 22 horas em atmosfera de 5% CO2em

ar e temperatura de 38,5°C com umidade máxima. Ao final do período de co- incubação, os prováveis zigotos foram lavados em TALP-FIV e transferidos para meio de cultivo de embriões.

4.3.3. Clonagem por transferência nuclear (TN) de células somáticas 4.3.3.1. Preparo das células somáticas doadoras de núcleo

Linhagens celulares de fibroblastos somáticos, derivadas de biópsia de pele de uma vaca Nelore (B. indicus) de 19 anos de idade foram utilizadas como fonte doadora de núcleos. O fragmento de pele resultante da biópsia foi dividido em pedaços menores (aproximadamente 3 mm) e os explantes foram cultivados em garrafas de 25mm2 contendo “Dulbecco’s Modified Eagle Medium” (DMEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, EUA), suplementado com 50% (v/v) de SFB e 83,4µg/mL de amicacina a 38,5°C e atmosfera de 5% de CO2 em ar e umidade

máxima. Este meio foi utilizado durante os três primeiros dias de cultivo para o estabelecimento da linhagem primária. Após isso, o cultivo celular foi mantido utilizando DMEM acrescido de 10% (v/v) de SFB e 83,4µg/mL amicacina. Quando a linhagem celular primária atingiu confluência, as células foram tratadas com 0,05% (m/v) de tripsina acrescida de 1% (v/v) de soro de galinha. Todas as passagens celulares foram cultivadas até a confluência. Células das passagens iniciais foram congeladas em DMEM suplementado com 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO, Merck & Co., Whitehouse Station, NJ, EUA) e armazenadas em nitrogênio líquido. Linhagens celulares cultivadas por três ou quatro passagens, submetidas (presumível G0) ou não (presumível G1) à privação

de soro, foram utilizadas nos experimentos de transferência nuclear. Para o grupo TN-G0 a privação de soro (DMEM + 0,5% de SFB) foi realizada por 3 a 5 dias

antes da reconstituição oocitária (WILMUT et al., 1997; KATO et al., 1998). Para o grupo TN-G1, as células não sofreram privação de soro.

4.3.3.2. Enucleação e reconstituição oocitária

Às 18 horas de MIV, COCs expandidos foram incubados em solução de hialuronidase 0,2% (m/v) por 5 minutos e submetidos a pipetagens para remoção das células do cumulus. Oócitos apresentando o primeiro corpúsculo polar foram selecionados e incubados por 15 minutos em fluido sintético de oviduto modificado (SOF; VAJTA et al., 1999) com 10µg/mL de bizbenzimida (Hoechst

33342) e 7,5µg/mL de citocalasina B a 38,5°C e atmosfera de 5% de CO2em ar e

umidade máxima. Os procedimento de micromanipulação foram realizados em SOF tamponado com HEPES (HSOF; WELLS et al., 1999) suplementado com 10% de SFB e 7,5µg/mL de citocalasina B. Para a enucleação, uma pipeta de borossilicato de vidro de 25µm de diâmetro externo foi utilizada para a remoção do primeiro corpúsculo polar e citoplasma adjacente. A enucleação foi confirmada pela visualização do carioplasto aspirado dentro da pipeta exposta à luz ultravioleta. Após a enucleação, os citoplastos retornavam ao meio de maturação onde eram mantidos até os procedimentos de reconstituição. Fibroblastos isolados foram transferidos para o espaço perivitelínico de cada citoplasto receptor e os complexos citoplasto-célula foram eletrofundidos em solução de manitol 0,28M contendo 0,05mM de cálcio, 0,1mM de magnésio e 0,3mg/mL de BSA. A eletrofusão foi induzida por dois pulsos diretos de 2,0kV/cm com duração de 20µs cada, utilizando equipamento BTX Eletrocell Manipulator 2001 (BTX, San Diego, CA, EUA). As taxas de fusão foram determinadas 30 a 60 minutos após a eletrofusão, e oócitos reconstituídos com sucesso foram incubados em HSOF + 10% de SFB a 38,5°C sob atmosfera úmida de 5% de CO2em ar.

4.3.3.3.Ativação dos oócitos reconstituídos

Oócitos reconstituídos foram quimicamente ativados 30 horas após o início da MIV, utilizando 5µM de ionomicina por 5 minutos em TCM 199 tamponado com HEPES e suplementado com 10% de SFB, seguido de incubação em SOF suplementado com 20mM de cloreto de estrôncio (SrCl2⋅6H2O, Mallinckrodt,

Hazelwood, MO, EUA) e 10µg/mL de citocalasina B por 6 horas a 38,5°C sob atmosfera úmida de 5% de CO2em ar (MÉO et al., 2005).

4.3.4. Obtenção de embriões partenogenéticos

Para a obtenção de embriões partenogenéticos (parteno), oócitos maturados por 24 horas foram desnudados, selecionados quanto à presença do primeiro corpúsculo polar e mantidos em meio de maturação até a ativação partenogenética. Após 30 horas de MIV, os oócitos foram ativados com ionomicina seguido por incubação em SOF + estrôncio + citocalasina B, conforme descrito anteriormente para a ativação dos oócitos reconstituídos.

Alguns dos embriões partenogenéticos destinados à transferência de embriões foram ativados com ionomicina seguido por incubação em 2mM 6- DMAP, em SOF, por 4 horas, nas mesmas condições de temperatura e atmosfera.

4.3.5. Cultivo embrionário in vitro

O cultivo embrionário foi realizado em microgotas de 100ҏµL de SOF contendo 5mg/mL de BSA livre de ácidos graxos (fração V) e 2,5% de SFB, em sistema de co-cultivo com células da granulosa, cobertas por óleo mineral. A cada 48 horas, o “feeding” era realizado pela substituição de 50% do volume da microgota por meio recém-preparado. Grupos de 10-20 embriões foram cultivados em cada microgota a 38,5°C sob atmosfera úmida de 5% de CO2em ar durante 7

dias, até o estádio de blastocisto.