Profiláticos e/ou promotores de crescimento

Para avaliação de drogas veterinárias usadas como promotores de crescimento ou profiáticos foram realizados ensaios de digestão anae- róbia usando 4 drogas veterinárias de uso frequente no Brasil. Neste caso, foram selecionados os antibióticos tiamulina, lincomicina, tilosina e gentamicina. Os ensaios descritos a seguir foram realizados no Labo- ratório de Biogás do Instituto de Engenharia Agrícola e Bioenergia (Landesanstalt für Agrartechnik und Bioenergie), na Universidade de Hohenheim, Stuttgart, Alemanha.

4.3.2.1 Reagentes

Os padrões de antibióticos utilizados neste experimento foram de qualidade VETRANALTM (Sigma-Aldrich, Alemanha): fumarato de tiamulina [C32H51NO8S], hidrocloreto mono-hidratado de lincomicina [C18H34N2O6S.HCl.H2O], tartarato de tilosina [C50H83NO23] e sal hidrato de sulfato de gentamicina [C60H127N15O26S]. Como controle positivo foi utilizado o inibidor 3,5-diclorofenol (Merck, Alemanha), grau analítico, conforme recomendações ISO 13641-1 (ISO, 2003).

4.3.2.2 Inóculo

Para o experimento foi utilizado inóculo previamente aclimata- do sob condições mesofílicas padronizadas no Laboratório de Biogás do Instituto de Engenharia Agrícola e Bioenergia, na Universidade de Stuttgart. O inóculo é derivado da planta experimental de biogás da Universidade de Hoheinheim (Unterer Lindenhof), de digestores opera- dos em condições mesofílicas e alimentados com dejeto de bovino, deje- to de suíno e grande variedade de silagens (ex.: milho, pastagens, etc). A aclimatação do inóculo ocorreu em reator de aço inoxidável de 100 li- tros de capacidade e a validação da atividade do inóculo seguiu proce- dimento padrão interno ao laboratório, conforme descrito por Mittweg et al. (2012).

4.3.2.3 Desenho experimental

Para os ensaios com os compostos profiláticos foi seguido o mesmo modelo do experimento descrito no item 4.3.1. A quantidade adicionada em cada reator foram baseadas em 5 ordens de grandeza (x, x.101, x.102, x.103, x.104) com a finalidade de extrapolar a faixa de con- centrações identificadas no ANEXO A e estimadas na Tabela 10. O detalhamento dos tratamentos utilizados é demonstrado na

Tabela 15.

Os ensaios de digestão anaeróbia foram efetuados por meio do sistema Hohenheim Biogas-yield Test (HBT), um sistema constituído 126 seringas de 100 mL como reatores (MITTWEG et al., 2012) con- forme demonstrado na Figura 11, em procedimentos batelada e de acor- do com recomendações da norma VDI 4630 (VDI, 2006). A preparação dos ensaios constituiu na incubação de 30 g de inóculo em seringas de vidro de 100 mL e adição de 0,35 g de substrato padrão. Individualmen- te, foram adicionados volumes variáveis de 50 a 1000 μL de solução de referência dos antibióticos, resultando nas concentrações de 0,05, 0,5, 5, 50 e 500 mg/L para tiamulina e tilosina, e de 0,1, 1, 10, 100 e 1000 mg/L para lincomicina e gentamicina. As seringas foram fechadas e mantidas em um suporte acoplado a um rotor e mantidas em estufa sob condições mesofílicas (37 °C ± 1) por um período de 35 dias. A produ- ção de gás foi mensurada por deslocamento do pistão das seringas, sen- do este corrigido às CNTP. Dependendo da quantidade de gás produzida (dV > 20 mL), o volume e a qualidade do biogás eram mensurados entre uma a três vezes ao dia. O metano presente no biogás foi determinado por sensor de dispersão de infravermelho (manufatura própria do labora-

tório), o qual foi calibrado diariamente antes do uso por meio de mistura padrão de gases metano e dióxido de carbono.

Para simular a condição de codigestão com substratos agropecuá- rios foi utilizada amostra padrão de concentrado para bovinos (KS Käl- ber 183 PELL, Raiffeisen Kraftfutterwerke, Alemanha). A composição da amostra encontra-se descrito na Tabela 16. Os cálculos para estima- ção da recuperação de metano e biogás foram efetuados de acordo com Mittweg et al. (2012).

Tabela 15. Desenho experimental para os ensaios de toxicidade por adição de profiláticos. Tratamento Inóculo (g) Substrato (g) Antibiótico Tipo Concentração 1 60 0 Nenhum - 2 30 0,35 Nenhum - 3 30 0,35 Tiamulina 50 μg/L 4 30 0,35 Tiamulina 0.5 mg/L 5 30 0,35 Tiamulina 5 mg/L 6 30 0,35 Tiamulina 50 mg/L 7 30 0,35 Tiamulina 500 mg/L 8 30 0,35 Lincomicina 100 μg/L 9 30 0,35 Lincomicina 1 mg/L 10 30 0,35 Lincomicina 10 mg/L 11 30 0,35 Lincomicina 100 mg/L 12 30 0,35 Lincomicina 1000 mg/L 13 30 0,35 Tilosina 50 μg/L 14 30 0,35 Tilosina 0.5 mg/L 15 30 0,35 Tilosina 5 mg/L 16 30 0,35 Tilosina 50 mg/L 17 30 0,35 Tilosina 500 mg/L 18 30 0,35 Gentamicina 100 μg/L 19 30 0,35 Gentamicina 1 mg/L 20 30 0,35 Gentamicina 10 mg/L 21 30 0,35 Gentamicina 100 mg/L 22 30 0,35 Gentamicina 1000 mg/L 23 30 0,35 3,5-dichlorophenol 150 mg/L

Com base nestas informações, foram obtidos os valores de ini- bição pela aplicação da Equação XI e posteriormente estimação das concentrações de inibição da produção de biogás a 10 e 50% (CI10 e CI50) por análise de regressão, conforme recomendações da norma ISO

13641-1 (ISO, 2003). Em todos os tratamentos foram subtraídos os valo- res de produção específica de biogás do inóculo, baseado no teor de sólidos voláteis provenientes do inóculo adicionado em cada teste. To- dos os ensaios foram efetuados em 3 repetições.

Após a finalização dos ensaios, o material resultante das 3 repe- tições de cada tratamento foram mesclados e homogeneizados. Uma fração de 10 mL foi encaminhada para determinação de ácidos orgâni- cos de cadeia curta (ou ácidos voláteis) via cromatografia em fase gaso- sa.

Figura 11. Desenho da vista lateral (A) e fotografia frontal da estufa contendo o sistema HBT (B). Detalhe do reator de seringa de 100 mL (C).

Legenda - 1: sistema rotor acoplado ao eixo do suporte, 2: seringas, 3: estufa, 4: suporte. Fonte: Adaptado de Mittweg et al. (2012).

Tabela 16. Composição da amostra padrão de ração concentrada

Parâmetro Concentração % (m/m) Sólidos totais 86,26 Sólidos voláteis 79,66 Proteína bruta 18,0 Gorduras totais 2,4 Fibra bruta 8,6 Cálcio 0,95 Fósforo 0,65 Sódio 0,30

Fonte: Raiffeisen Kraftfutterwerke, Alemanha

A)

B)

C)

1

2

3

4

4.3.2.4 Determinação de ácidos orgânicos de cadeia curta

Para avaliação do acúmulo de ácidos orgânicos de cadeia curta (acético, propiônico, iso-butírico, n-butírico, iso-valérico, n-valérico e capróico) foi utilizada metodologia descrita por Krümpel et al. (2016). Em 1 mL de amostra foi adicionado 1 mL de ácido ortofosfórico a 17% (v/v) e 1 mL de ácido n-metilvalérico (como padrão interno). Uma dilui- ção 1:10 (v/v) foi preparada em água, no qual é transferida para os fras- cos do auto-amostrador acoplado ao cromatógrafo de fase gasosa Varian CP-3800 (Varian, EUA). As análises cromatográficas foram efetuadas com detector por ionização em chama após separação dos analitos de interesse em coluna WCOT (sílica fundida - 50 m, 0,32 mm) em gradi- ente de temperatura: 60 °C por dois minutos, seguido de aumento de temperatura a 150 °C (30 °C/min) e após 240 °C (8 °C/min). O gás car- reador foi Hélio de elevada pureza.

5.1 ACLIMATAÇÃO DE INÓCULO ANAERÓBIO MESOFÍLICO